论文部分内容阅读
蛋白质的糖基化对其正确折叠、生物活性、溶解度、抗原性和稳定性等功能起到重要作用,但由于糖基化对蛋白功能调节的机理尚不清楚,使有目的地通过糖基化对酶蛋白进行改性受到限制。因此,本文以毕赤酵母为表达宿主,以β-葡萄糖醛酸苷酶为研究对象,利用半理性设计及分子动力学模拟方法,并结合糖蛋白光谱学和热力学特性研究糖链与蛋白的结合构象及构象与功能之间的关系,为利用糖基化对酶蛋白进行定向改性提供理论基础,主要研究结果如下:分析并鉴定了β-葡萄糖醛酸苷酶的潜在糖基化位点,确定了四个位于不同结构域的潜在糖基化位点,发现N28位糖基化能显著提高酶的活性,N383位能显著提高酶的热稳定性,N231位对酶活及蛋白稳定性无显著影响,而N594位的糖链对其它三个位点的糖链与蛋白之间的稳定构象起到平衡作用。采用半理性设计获得了位于该酶12个Loop/Turn的22个新糖基化位点,其中N26、N150和N543位点糖基化修饰后可大幅度提高酶活,同时N26和N150位点的修饰还提高了酶的催化效率,而N115和N418位点的修饰提高了酶对底物的亲和性。研究还发现不同位点的糖基化对酶的最适pH和最适温度范围无显著影响,但N40位点的糖基化修饰使酶在70 oC半衰期提高到了147.5min,提高了近十倍,而N418位点修饰却显著降低了酶的热稳定性。研究了糖基化调节酶热稳定性的机理,发现糖基化修饰后热稳定性好的糖基化突变酶N40中点转换温度Tm3最高,为75.07 ℃,变性焓变（ΔH）较小,且比其它突变酶多一次构象转换,而热稳定最差的糖基化突变酶N418的Tm3比其它酶降低了至少5℃,且ΔH较大。荧光光谱和圆二色光谱分析表明糖链的修饰使蛋白荧光发射基团微环境的极性增加,改变了酶蛋白的三级结构,70℃孵育后只有N40仍保留较好的二级结构,且酶去折叠中间态的自由能变提高了16kcal·mol-1,显著增加了酶的构象稳定性。分子动力学模拟显示N40位点的糖链在两个亚基间形成了“糖基发卡”的结构,分子内能最小;N208位的糖链则在三个结构域相互作用的交界处形成了“糖基垫片”的结构;而N418位上的糖链易于随环境的改变而摆动,并与催化活性位点相邻,分子内能最大。在研究酶的多位点糖基化效应时发现热稳定性好的糖基化修饰具有叠加效应,“糖基发卡”结构在显著提高酶热稳定性的作用方面不受其他糖链修饰的影响,且该结构不会影响酶的催化反应类型及特异性。