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乳铁蛋白(hlf)是转铁蛋白家族中的成员之一,主要分布在哺乳动物的乳汁、血液、泪液、胆汁、精液、羊水和小肠液等分泌物中。具有多种生物功能:能促进人体对铁的吸收和利用、能抵御病菌侵染、具有免疫调节、抗氧化、抑制癌细胞的生长等作用。把人乳铁蛋白基因转入番茄,使番茄植株合成具有生物活性的人乳铁蛋白,从而提高番茄的营养保健品质。乳铁蛋白可促进转基因番茄对铁的吸收、贮存,进而提高番茄铁的含量,同时还可提高转化植株抗病性。 本研究以番茄品种“强丰”的子叶为试验材料,研究了其组培再生体系,结果表明,MS+ZT2.0 mg/L+IAA0.2mg/L培养基的生芽率较高,达到68%左右。抗生素敏感性试验表明,适宜的卡那霉素筛选浓度是50mg/L。 本研究分别构建含人乳铁蛋白基因高效植物表达载体质粒pBIhLF(含kanr选择标记基因)和p1300UbihLF(无选择标记基因)。pBIhLF的T-DNA区含有目的hlf基因和标记kanr基因,hlf的启动子为35S启动子;质粒p1300UbihLF的T-DNA区仅含有目的基因hlf,hlf的启动子选用玉米Ubiquitin启动子。经酶切、PCR鉴定表明:载体构建正确,适合于番茄的遗传转化。采用冻融法将两个表达载体分别导入农杆菌EHA105中。 农杆菌的不同预处理及转化方法对番茄子叶遗传转化的研究表明:采用YEB液体培养基培养,农杆菌菌液浓度在OD600=0.8~1.0时,侵染福建农林大学硕士学位论文15min,转化效率较高。共培养时加适量的乙酞丁香酮(AS,20“M)对转化具有促进作用。共培养3天转化频率达到了最高水平。 采用单农杆菌EHA105(pBIhLF)转化番茄“强丰”子叶数,共计1026个,经筛选获得5个抗性芽,最高转化率达0.82%,平均转化率为0.49%(转化6次);有两株抗性芽在生根培养基上再生获得完整植株。PCR检测和Southem blot杂交表明:外源基因已整合到抗性植株的基因组中。 采用双农杆菌EHA 1 05(pBIhLF+p1300UbihLF)共转化“强丰”子叶746个,未能获得抗性芽;因此,如何利用共转化系统获得无标记转基因番茄,尚待于进一步深入地研究。另外,Western杂交和抑菌实验正在进行之中。