肿瘤是影响人类健康最重要的疾病之一，据统计，全球每年因癌症死亡的人数高达800万，而每年新增的肿瘤患者更是达1300-1400万。肿瘤的治疗也从单一的方案变为多方式的综合治疗，包括传统的手术切除，放化疗，以及内分泌治疗和新兴的免疫治疗等。然而，癌症的发生是一个多种因素参与的多阶段的复杂的病理过程，因此，癌症的治疗也是复杂的。目前，针对肿瘤的治疗手段都存在着一定的局限性，因此常常选用多种方案联合治疗，然而，目前尚未完成彻底治愈肿瘤的目标。1985年NIH，将肿瘤的生物治疗（小分子靶向治疗、细胞因子治疗、单克隆抗体等）列为继手术、化疗、放疗后的第四种治疗方法，彰显了肿瘤生物治疗的重要地位。近年来，研究人员一直致力于研发新免疫疗法，肿瘤的免疫治疗也取得了重大进展，包括过继T细胞疗法、免疫检验点的单克隆抗体、肿瘤疫苗等。理论而言，肿瘤生物治疗有许多传统疗法无可比拟的优势，如副作用小、疗效好、更具有个性化等。但是，同样存在成本高、研发难度大等局限。　　程序性死亡因子-1(programmeddeath-1，PD-1)即CD279为Ⅰ型跨膜蛋白，隶属于免疫球蛋白超家族，其相对分子量约为55000KD。它主要在多种活化的免疫细胞表面上表达如:T细胞、B细胞、树突状细胞以及NK细胞等。PD-1有两个配体分别为程序性死亡配体-1(programmeddeathligand-1，PD-L1)即B7-H1或CD274和程序性死亡配体-2（programmeddeathligand-2，PD-L2）即B7-DC，这两个配体都属于B7家族。编码PD-L1的基因位于第9号染色体，其编码的产物为含有290个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白。正常情况下组织中几乎不表达PD-L1，但活化T细胞，B细胞、DC和巨噬细胞表达PD-L1等，同时心脏内皮、胰岛等细胞也少量表达PD-L1。正常情况下，PD-L1能与PD-1结合，后者是一种负性T细胞共刺激分子，两者结合后能减少免疫反应对正常组织的损伤，从而实现免疫系统的稳态。近年来研究结果显示，PD-L1在胃癌、乳腺癌、黑色素瘤和肺癌等多种肿瘤中过表达。高表达的PD-L1能与PD-1结合，抑制了肿瘤微环境中T细胞的活化和抗肿瘤免疫反应，进而使得肿瘤细胞可以免受免疫系统的杀伤，实现免疫逃逸。由此可见，PD-1/PD-L1信号通路的阻断，可以恢复T细胞的生物学活性，重新恢复机体的抗肿瘤免疫反应。　　近年来过继性免疫效应细胞治疗迅速发展，一度引起医学界的热议，而嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor Tcells，CAR-T)更是成为该领域的新星。CAR-T是利用基因工程技术，将特定的肿瘤抗原的单克隆抗体的单链可变区的基因与T细胞信号转导区的基因连接起来，组成一段融合基因后，通过病毒载体或转座子系统转导到T细胞内。在体外用细胞因子等方式刺激活化增殖后，再输回入病人体内，进一步发挥抗肿瘤作用。其中单链抗体是CAR结构中的关键部位，它负责识别肿瘤特异性的抗原，也就是所谓的靶点，如CD19，HER2，EGFR等，它能通过MHC非限制性方式激活T细胞，即它不需要像TCR一样只能识别抗原提呈细胞加工提呈的抗原多肽。因此CAR具有很强的理论优势:一方面，CAR仍可以识别那些MHC下调或丢失的肿瘤细胞，使处于无能状态的T细胞重新识别并杀伤肿瘤细胞;另一方面，CAR胞内区含有免疫受体酪氨酸活化基序(immuno receptor tyrosine-basedactivationmotifs，ITAM)如CD3ξ、FcεRIγ并含有共刺激信号，这可以使CAR-T细胞长时间存活。目前，该疗法已在白血病、淋巴瘤等血液系统疾病中取得了重大成果，其在多种其他实体肿瘤中也效果显著，有着广泛的应用前景。　　本文首次将PD-L1作为肿瘤相关抗原构建CAR-T。本实验分为两部分:第一部分，合成抗PD-L1单链抗体的基因序列，并亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中;酶切鉴定其准确性后用脂质体转染法将其转染到COS-7细胞中，收集分泌到细胞上清中的抗PD-L1单链抗体，浓缩后经SDS-PAGE电泳鉴定，并用细胞ELISA检测其活性。第二部分，合成抗PD-L1-CD28-CD3ξ融合基因的序列，通过酶切载体将目的基因与慢病毒载体连接，经DNA酶切鉴定后，将含目的基因的病毒载体同包装质粒一起转染于293T细胞中，用流式细胞仪检测是否包装成功，收集大量的病毒颗粒并进行浓缩，并感染CD3T细胞，用流式细胞术验证CAR-T的构建，并用IFN-γ酶联免疫法检测CAR-T的活性。　　第一部分 抗PD-L1scFv基因的合成、表达及活性检测　　目的:合成和表达抗PD-L1的单链抗体，及其亲和活性的检测。方法:合成抗PD-L1单链抗体的基因序列，并亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中;酶切鉴定其准确性后用脂质体转染法将其转染到COS-7细胞中，收集分泌到细胞上清中的抗PD-L1单链抗体，浓缩后经SDS-PAGE电泳鉴定，并用细胞ELISA检测其活性。结果:测序及酶切结果显示抗PD-L1表达载体构建准确，SDS-PAGE电泳结果显示在55KD处有一条带，与预期一致。ELISA结果表明抗PD-L1 scFV能与PD-L1+的肺癌株5853细胞结合，但抗PD-L1 scFV不能与PD-L1阴性表达的肺癌A549细胞株结合。结论:成功表达了抗PD-L1 scFV，且其具有能与PD-L1+细胞特异性结合的生物学活性。　　第二部分 抗PD-L1-CD28-CD3ξ的CAR-T的构建及活性检测　　目的:构建抗PD-L1-CD28-CD3ξCAR-T并检测其活性。方法:设计抗PD-L1-CD28-CD3ξ融合基因的序列，通过酶切载体将目的基因与慢病毒载体连接，酶切鉴定其准确性后将病毒载体同包装质粒一起转染于293T细胞中，将收集并浓缩的病毒颗粒，感染CD3T细胞，用流式细胞术验证CAR-T的构建。用IFN-γ酶联免疫法检测CAR-T的活性;结果:测序及酶切结果显示抗PD-L1-CD28-CD3ξ表达载体构建准确，FCM检测到目的蛋白在CD3T细胞中表达。抗PD-L1CAR-T与PD-L1+5853细胞作用后释放的IFN-γ的含量明显高于PD-L1-A549细胞，p＜0.05。结论:成功构建了抗PD-L1-CD28-CD3ξCAR-T，且其能特异性识别PD-L1阳性细胞。