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研究背景结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,发病率位居消化道肿瘤第三位。在我国,由于人们生活习惯和饮食结构的变化,以及结肠癌起病隐匿,发展缓慢,早期难以察觉,发现时多已处于中晚期,各种治疗手段效果均不理想,结肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。复发和转移是结肠癌患者死亡的主要原因,结肠炎症、异常增殖、分化、凋亡等多种机制与结肠癌的发病过程密切相关。HOX基因是同源盒基因(homeobox gene)大家族中的一员,是生物进化过程中具有高度保守性的一类基因。近年来研究发现HOX基因在细胞增殖与分化、决定细胞表型以及在胚胎发育等方面起关键作用,其表达失调会引起胚胎发育过程中机体畸形,以及肿瘤的发生。HOXD3基因是HOX家族基因的第三旁系同源基因群成员,HOXD3基因表达异常可导致组织器官发育异常,以及血管异常生长。相关研究显示HOXD3的异常表达可能会通过改变细胞粘附因子和肿瘤转移相关调控因子的表达,促使肺癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发生和转移。本研究通过观察结肠癌组织中HOXD3的表达情况,以及在结肠癌RKO细胞中HOXD3所发挥的生物学调控功能,分析HOXD3基因对结肠癌增殖、凋亡作用的分子调控机制,为结肠癌的临床诊疗和预后评估提供新的参考途径。目的研究HOXD3基因在结肠癌组织中的表达以及对结肠癌RKO细胞生物学功能的影响,分析HOXD3的基因对结肠癌增殖、凋亡作用的分子调控机制。方法1、免疫组化法检测结肠癌病理组织与正常组织中HOXD3的表达情况;采用Spearman相关分析法对84例结肠癌患者的性别、年龄、分化程度、浸润深度、TNM分期等临床病理特征与HOXD3表达的相关性进行分析。2、采用RT-PCR法检测DLD-1、HCT116、SW620、HT-29、RKO结肠癌细胞株中HOXD3基因的表达;制备、包装HOXD3基因RNAi慢病毒载体并感染RKO细胞;通过Cellomics细胞计数检测HOXD3基因敲减后RKO细胞生长情况;用MTT法检测HOXD3基因敲减后RKO细胞增殖情况;检测HOXD3基因敲减后RKO细胞克隆形成能力的变化情况;用荧光活化细胞分选方法检测HOXD3基因敲减后对RKO细胞细胞周期以及凋亡情况的影响。3、Affymetrix基因表达谱芯片分析HOXD3敲减后影响RKO细胞增殖、凋亡作用的信号通路及下游差异基因;用q PCR法验证RKO细胞中下游差异基因的表达情况。结果1、HOXD3在结肠癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织,在高-中分化、低分化结肠癌组织中阳性率分别为68.2%(30/44)、70%(28/40),显著高于癌旁正常组织9.1%(3/33)。结肠癌患者HOXD3基因的表达与TNM分期、浸润程度相关,肿瘤临床分期越晚、浸润程度越深,HOXD3表达阳性率越高;HOXD3的表达与患者性别、年龄、分化程度无相关性。2、在DLD-1、HCT116、SW620、HT-29四种结肠癌细胞株中HOXD3基因中度表达,而在RKO细胞株中HOXD3基因呈现高表达。将目的基因RNA干扰慢病毒载体感染RKO细胞,经q PCR检测感染后的RKO细胞中HOXD3基因敲减效率达到53.9%,在m RNA水平的表达量受到显著抑制;在肾上皮细胞系293T细胞中HOXD3基因的外源表达蛋白水平也显著降低。经sh RNA慢病毒感染后,与对照组比较,实验组RKO细胞的增殖速率受到显著抑制,而且RKO细胞集落数目减少。经流式细胞仪检测发现,与对照组比较,实验组处于G1期、S期的细胞数显著减少,而处于G2期的细胞数显著增多。通过Annexin V-APC单染法检测,显示实验组发生凋亡的RKO细胞数显著增加。提示HOXD3基因敲减后,RKO细胞发生了细胞周期G2期阻滞,并诱发了细胞凋亡。3、基因芯片分析结果显示,HOXD3敲减后RKO细胞中有366个差异基因表达上调,377个基因表达下调。通过IPA通路分析软件发现,与HOXD3作用相关的信号途径中,ERK-MAPK信号通路显著被抑制,在通路中富集的相关差异基因有PIK3R3、PAK6、ARAF、PPM1J、PIK3C3、RAC1、STAT1、RAP1A、PLA2G12A等9个相互作用密切的基因;P53信号通路被激活,存在PIK3R3、BCL2L1、PMAIP1、TP53INP1、CCND2、PIK3C3、CDKN1A、CCNK、RRM2B、TIGAR、MDM2、FAS等12个与其相关的差异基因。采用q QCR法对两条通路中的ARAF、RAC1、RAP1A、PLA2G12A、PIK3R3、PIK3C3六个基因的表达情况进行了验证,发现ARAF表达显著上调,RAC1、RAP1A、PLA2G12A、PIK3R3、PIK3C3表达均显著下调。结论1、HOXD3基因在结肠癌癌旁组织中低表达,在癌组织中高表达;HOXD3基因高表达与肿瘤TNM临床分期、肿瘤浸润深度呈正相关,与患者年龄、性别、肿瘤分化程度不相关。2、在RKO结肠癌细胞株中HOXD3基因高表达;HOXD3基因敲减后,RKO细胞增殖、克隆形成能力显著被抑制,细胞周期阻滞在G2期,细胞凋亡程度显著增加。3、基因HOXD3被敲减后,细胞内ERK-MAPK信号通路显著被抑制,P53信号通路被激活。通路中HOXD3下游差异基因ARAF表达上调,RAC1、RAP1A、PLA2G12A、PIK3R3、PIK3C3表达下调,这些基因通过ERK-MAPK和p53通路的交互作用,发挥了抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡的作用。