【摘 要】
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本文首先将pFRT/lacZeo质粒转染CHO-K1细胞,经半乳糖苷酶活性检测筛选得到了含高活性位点的细胞株CHO/FRT2。通过定点突变对NESP1(专利报道序列)序列进行了密码子优化,得到了
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本文首先将pFRT/lacZeo质粒转染CHO-K1细胞,经半乳糖苷酶活性检测筛选得到了含高活性位点的细胞株CHO/FRT2。通过定点突变对NESP1(专利报道序列)序列进行了密码子优化,得到了NESP2、NESP3,并构建了相关的表达载体peDNA5/FRT/NESP。将表达载体与含FLP酶基因的pOG44质粒共转CHO/FRT2细胞,得到了高效表达重组NESP的细胞株CHO/FRT2/NESP；NESP1、NESP2、NESP3的表达水平分别为786 IU/ml、1315 IU/ml、1029 IU/ml,表明经过密码子优化的NESP2具有更高的蛋白表达水平。
此外,将载体pcDNA5/FRT/NESP2转染各CHO/FRT细胞,ELISA检测结果显示NESP2的表达与半乳糖苷酶活性水平趋势相同,证实半乳糖苷酶作为筛选指示蛋白,可以用来筛选有效的蛋白表达热区。
之后,通过蓝胶亲和层析,凝胶过滤,离子交换层析纯化了重组CHO/FRT2/NESP2细胞培养上清,得到了一定量初步纯化的重组NESP蛋白样品。通过SDS.PAGE电泳和Western blot分析证实,相对于原型EPO,NESP具有更高的分子量。等电聚焦分析结果也进一步证实NESP比EPO具有更高的唾液酸丰度,糖基化程度更高。
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