腱/韧带是坚韧的结缔组织,它们通过其结构、力学性质和外形的变化以响应外力的刺激,在运动中起着重要作用,但活动范围超过极限或拉扯过剧,腱/韧带常常会受到损伤甚至断裂,严重影响人们的健康。腱/韧带损伤的治疗目前仍然是整形外科中具有挑战性的问题,比如如何加快治疗速度、提高治疗质量直至完全治愈等等,都是临床上亟待解决的难题。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有增殖和多向分化潜能的特殊细胞群。在某些特异诱导条件下,骨髓间充质干细胞在体外可增殖并分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞等。这种分化可塑性为弥补临床上腱/韧带组织的缺乏带来了希望,使腱/韧带创伤的更好治疗甚至组织工程化成为可能。但关于力学加载调节骨髓间充质干细胞向肌腱成纤维细胞定向分化的研究工作,至今尚未见详细报道。为此,本文研制一种细胞体外拉伸加载的装置,研究机械拉伸对骨髓间充质干细胞定向分化的调节作用,寻找调节骨髓干细胞定向分化为腱/韧带成纤维细胞的机械拉伸加载条件,并采用分子生物学等手段对分化过程中的标志基因Collagen I (Col I)、Collagen III (Col III)、Tenascin (TNC)、Scleraxis(SCX)的表达变化进行定量描述。主要研究工作和结果如下:①大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells, rMSCs)的原代分离培养利用密度梯度离心结合差异贴壁法进行rMSCs的原代分离培养,结果表明:1.073g/ml的percoll密度梯度离心结合差异贴壁分离得到的细胞为形态比较均一的单核细胞,用含10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基培养24 h后细胞开始贴壁,继而分裂增殖,呈集落式生长,约2周后接近融合,呈纺锤形或长梭形的成纤维细胞样形态。其间有漂浮不贴壁的造血细胞等杂细胞,在反复换液中被除去。传代后细胞贴壁、生长较快,约一周可达到融合,呈长梭形或纺锤形均匀分布。考马斯亮蓝观察细胞骨架结构,发现骨架蛋白呈蓝色束状,而且其走向和细胞长轴平行。②rMSCs的鉴定和周期分析利用免疫染色方法考察了分离培养的细胞表面部分抗原的表达,利用流式细胞技术分析了细胞周期的分布。结果发现:细胞表面抗原CD34(造血干细胞标记物)呈阴性;CD44和CD29呈阳性表达。细胞周期分析显示G0/G1期细胞占(89.74±3.87)%,S期细胞占(2.49±2.2)%,G2/M期细胞占(7.7±3.7)%,表明大部分细胞处于非增殖状态。③机械拉伸加载装置的加工制作根据基底膜形变原理,自行研制了单轴细胞拉伸装置。实验装置由控制系统、机械系统、电机系统、冷却系统和培养腔五个部分组成,实现拉伸-保持-恢复-保持-拉伸的单轴周期性拉伸加载方式。系统的综合评价表明:该装置运行稳定,温度可控,拉伸频率及应变大小可调(频率范围0.01-1.5HZ,应变范围0-50%),拉伸时间人为控制,操作简便,可对细胞进行不同频率、时间和应变大小的拉伸加载。④拉伸加载对rMSCs向肌腱成纤维细胞定向分化的诱导本文考察了rMSCs在频率0.1Hz、形变大小10%的单轴纵向周期拉伸加载条件下的形态变化和相关基因的表达。结果表明:持续拉伸加载24 h,rMSCs排列开始发生变化,拉伸48 h,细胞变得细长,其排列方向和拉伸方向成60o至90o夹角,大部分细胞垂直于受力方向排列。RT-PCR分析发现,和对照组(同样条件的静态培养)比较,拉伸加载24 h,Col I和Col III表达明显增加,但实验组和对照组均没有表达TNC和SCX。拉伸加载48h, Col I和Col III的表达回到对照组水平,但TNC和SCX在拉伸组rMSCs中表达,而对照组不表达TNC和SCX。结果表明,拉伸加载24 h,Col I和Col III在rMSCs中的表达迅速增加;拉伸加载48h,肌腱细胞特异标记基因TNC和SCX等开始表达,表明rMSCs向肌腱成纤维细胞定向分化。实验还进行了大鼠肌腱成纤维细胞的原代分离培养,检测了大鼠肌腱细胞相关标志基因的表达情况。RT-PCR分析结果发现,肌腱成纤维细胞大量表达Col I和Col III,弱表达TNC和SCX。本文的研究结果对定量认识机械拉伸调节骨髓间充质干细胞向肌腱成纤维细胞定向分化及其相关规律有重要意义,为临床上腱/韧带创伤的治疗及其组织工程化提供了定量的参考依据。