过表达Bmstat对家蚕细胞增殖及转录模式的影响

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JAK/STAT信号通路是一条多种细胞因子共同作用的信号传导途径,其相关蛋白及基本功能在生物体中相对保守,为了解家蚕中JAK-STAT通路对细胞增殖的影响,构建了过表达stat的转基因载体pIZT-STAT。将pIZT-STAT转基因载体转染家蚕BmN细胞,通过Zecon连续筛选三个月后,获得稳定转化细胞。并分别通过MTT、流式细胞仪等检测稳定转化细胞增殖情况;利用高通量转录组测序技术(RNA-Seq)研究过表达BmSTAT的稳定转化细胞和正常BmN细胞的转录组学。实验结果发现过表达BmSTAT后,细胞增殖速度加快,与发育相关基因出现上调。对过表达BmSTAT基因的稳定转化细胞和正常BmN细胞的比较转录组学研究发现:正常家蚕细胞中共有10853个基因表达,以家蚕ActinA3基因表达水平为参照,发现在家蚕细胞中log2(Foldchange)>2的高表达基因有41个,这些基因的产物主要涉及蛋白合成、天然免疫、信号转到、环境适应;在转化细胞中共有10129基因表达。Foldchange(FC)达到显著性的差异表达基因(即只在一个样本中表达的差异基因)共252个,表达上调的基因123个,下调基因129个;T-test达到显著性的差异表达基因(二个样品均表达的差异表达基因)共800个,其中表达上调的基因787个。WEGO分析结果显示,表达上调基因主要集中在细胞、细胞组分、大分子复合物、代谢进程、细胞进程、催化活性、结合等。通过KEGG通路分析发现,在碳代谢、氨基酸的合成、氧化磷酸化、嘌呤代谢、嘧啶代谢、剪接体、核糖体、RNA转运、核糖体的合成、蛋白质在内质网的加工、转录、翻译、细胞的周期和凋亡等富集了大量的过表达基因。与Ras、Rap1、MAPK、Wnt、Hippo、JAK/STAT、FoXo、Ca2+、PI3-AKt、mTOR等信号途径相关的基因也出现了许多基因上调,同时发现在细胞周期的调控信号通路中也出现了11个上调的基因。同时测到下调基因有13个,WEGO分析显示与细胞,细胞组分,代谢过程,obsoletemolecularfunction,细胞进程,催化活性,转运蛋白活性有关。KEGG通路分析发现,这些基因涉及氧化磷酸化,甲烷代谢。表明JAK-STAT信号通路在调节细胞的生长发育、增殖过程中起着重要作用。将过表达BmSTAT稳定转化细胞与正常BmN细胞分别感染BmCPV经裂解的多角体病毒BmCPV。分别在2天和6天用westernblotting检测VP7的表达水平,发现稳定转化细胞和正常细胞之间对BmCPV感染没有显著差异。说明家蚕JAK/STAT信号通路对BmCPV增殖没有影响。
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