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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶是一种位于细胞质膜的多亚基复合体,是机体生成活性氧(ROS)的主要酶类之一。NADPH氧化酶在清除病原微生物和免疫调节等方面发挥重要作用,其功能异常将导致机体抗感染能力降低而引起炎性损伤。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium, S. Typhimurium)是肠杆菌科的兼性胞内寄生菌,因其对人类、畜禽饲养业造成严重危害而受到广泛重视。沙门氏菌可以通过肠上皮组织进入肠系膜淋巴结,扩散至循环系统,引起肠道及全身性免疫应答反应。不同于胞内致病菌沙门氏菌,鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium, C. rodentium)是一种通过粘附脱落损伤效应(attaching and effacing, A/E)引起鼠类暂时性结肠炎的病原菌。因此,本研究拟以NADPH氧化酶p40phox亚基缺陷小鼠为研究对象,探讨p40phox亚基对机体抗沙门氏菌和柠檬酸杆菌感染能力的影响,阐明其调控机体免疫功能的作用机理。主要研究内容及结果如下：(一)p40Phox亚基缺失对小鼠抗全身性沙门氏菌感染的影响对6至8周龄p40phox-/-和C57BL/6雌性小鼠灌胃感染3×108CFU鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium),研究p40phox亚基缺失对小鼠抗沙门氏菌感染的影响。实验结果表明：(1)感染S. Typhimurium后,p40phox-/-小鼠死亡率显著提高而体重显著降低,其脾脏及肝脏载菌量均显著高于对照组C57BL/6小鼠;(2)p40phox亚基缺失加重了S. Typhimurium感染引起的脾脏及肝脏组织病理损伤,显著提高了感染组织内炎性因子白介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α的表达水平；(3)与对照小鼠相比,p40phox-小鼠脾脏组织内CD4+T细胞、CD11b+F4/80+巨噬细胞及Ly6G+CD11b+中性粒细胞浸润均显著增加,角化细胞趋化因子KC、单核细胞趋化蛋白MCP-1和巨噬细胞炎症蛋白MIP-2的基因表达水平也显著上调；(4)对p40phox小鼠腹膜内注射5000 CFU沙门氏菌后,其募集炎性细胞向感染部位聚集的功能未受影响。以上结果提示,p40phox亚基在小鼠抵御全身性沙门氏菌感染方面具有重要作用。(二)p40phox亚基缺失对沙门氏菌感染所致的结肠炎的影响对链霉素预处理的p40phox-/-和C57BL/6小鼠灌胃感染1×108CFU鼠伤寒沙门氏菌(5. Typhimurium),研究p40phox亚基缺失对小鼠沙门氏菌结肠炎的影响。实验结果表明：(1)感染S. Typhimurium后,p40phox-/-小鼠肠道病理损伤更为严重,表现为黏膜水肿严重、绒毛结构破坏以及炎性细胞的大量浸润；(2)亚基缺失促进了S. Typhimurium感染所致的钙黏附蛋白E-cadherin和闭锁小带蛋白ZO-1再分布,显著提高了p40phox/-小鼠肝、脾、MLN组织载菌量；(3)感染S. Typhimurium后,pWox-/-小鼠肠道内黏液蛋白MUC2及唾液酸转移酶St3ga14的基因表达水平显著低于C57BL/6对照组,且S. Typhimurium感染未能显著上调p40phox小鼠肠道内岩藻糖转移酶FUT9的基因表达；(4)p40phox亚基缺失显著提高了盲肠黏膜固有层内F4/80+巨噬细胞和Ly6G+中性粒细胞的浸润,且浸润细胞多聚集于肠上皮细胞基底侧。以上结果提示,p40phox亚基在维持肠道屏障功能及缓解沙门氏菌引起的细菌性结肠炎方面发挥重要作用。(4)亚基缺失对小鼠巨噬细胞免疫功能的影响本实验以p40phox-/-和C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞为材料,研究p40phox亚基缺失对巨噬细胞免疫功能的影响。实验结果表明：(1)亚基敲除后对细胞吞噬功能没有影响,但其杀菌能力受到显著抑制；(2) p40phox亚基缺失的巨噬细胞及中性粒细胞产生活性氧ROS的能力显著下降；(3) p40phox-/-巨噬细胞的自噬功能受损,表现为微管相关蛋白轻链LC3、自噬相关蛋白Atg3、Atg12-Atg5复合物的表达水平显著降低,自噬体与S. Typhimurium的共定位也显著减少；(4)p40phox-/-巨噬细胞内IL-1β的含量及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspase-1活性显著高于对照组,表明p40phox亚基缺失诱导了炎性小体的过度活化。以上结果提示,p40phox亚基对维持巨噬细胞正常的免疫功能具有重要作用。(四)p4ophox亚基缺失对小鼠抗柠檬陵杆菌感染的影响对6至8周龄p40phox-/-和C57BL/6雌性小鼠灌胃感染5×108CFU柠檬酸杆菌(C. rodentium),研究p40phox亚基缺失对柠檬酸杆菌感染诱导的小鼠结肠炎的影响。实验结果表明：(1)感染C. rodentium后,p40phox亚基缺失对小鼠体重及细菌清除率无显著影响；(2)亚基缺失对C. rodentium感染引起的肠道病理学变化、炎性因子表达及细胞浸润无显著影响,但在未接触病原菌的情况下p40phox-/-小鼠结肠内炎性因子IL-1β和TNF-α的表达水平及巨噬细胞数量均显著高于对照组C57BL/6小鼠；(3)感染C. rodentium后,p40phox-l-小鼠MLN及脾脏细胞培养上清中IL-10的水平显著升高,而IL-17的含量显著低于对照组;(4)亚基缺失显著提高了肠道和脾脏组织内诱导型一氧化氮合酶iNOS表达以及脾脏细胞一氧化氮的分泌。以上结果提示,p40phox亚基缺失对小鼠柠檬酸杆菌感染所致的结肠炎没有显著影响。综上所述,NADPH氧化酶p40phox亚基在抵御沙门氏菌感染、缓解沙门氏菌所致的结肠炎、维持活性氧ROS水平及巨噬细胞正常免疫功能等方面发挥重要作用,但对小鼠抗柠檬酸杆菌感染没有显著影响。