第一部分慢性免疫性血小板减少症患者血小板减少与凋亡相关性探讨研究背景与目的:免疫性血小板减少症(ITP)是原因不明的由各种诱因引起的一种自身免疫性出血性疾病,ITP典型特征是血小板减少。慢性ITP是指血小板减少持续超过12个月以上,近20%儿童患者和几乎所有的成人患者会演变成为慢性ITP。起病缓慢或隐袭,呈持续性和反复发作性特点。ITP的病因及发病机制错综复杂,目前尚未阐述清楚。大量研究表明血小板的生成与衰老和凋亡密切相关,并影响了它们的寿命。细胞凋亡是细胞内部基因调控下按既定程序自身主动参与的一种特殊的死亡形式,作为维持机体自身稳定的重要调节机制,与机体发育、组织自稳定、肿瘤、免疫反应的调节等密切相关。大量研究表明血小板也可以发生凋亡并影响了它们的寿命。目前血小板凋亡是否参与了ITP血小板减少的发病机制尚不清楚,本研究目的在于通过对ITP患者的血小板凋亡分子进行检测,从而探讨凋亡是否在慢性ITP血小板减少中发挥一定作用。方法:收集40例慢性ITP患者及40例正常对照外周血液标本,我们应用流式细胞术检测了凋亡指标:PS膜外翻和线粒体膜电位变化。同时应用荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blotting分别检测了Bcl-x L、Bak和Bax m RNA表达水平和蛋白表达水平。结果:我们研究结果显示粒体膜电位去极化血小板ITP组(5.62±0.78%)明显高于健康对照组(3.23±0.32%)(P<0.0001)。而PS膜外翻阳性的血小板ITP组(9.75±1.63%)也明显高于健康对照组(4.32±0.15%)(P<0.0001)。两组Bcl-x L m RNA表达水平比较,ITP组(0.68±0.03)则明显低于健康对照组(0.93±0.13,P<0.0001)。ITP组Bcl-x L蛋白表达水平也比对照组低,但差别不是很明显。此外,Bak和Bax m RNA表达水平ITP组(分别为1.42±0.12和1.83±0.05)明显高于对照组(分别为0.95±0.07和1.02±0.06)。Bak和Bax蛋白表达水平两组比较则无统计学区别。Bcl-x L和Bak,Bcl-x L和Bax比值,两组比较ITP组则要低于健康对照组(P<0.05)。结论:我们研究结果指出慢性ITP患者血小板凋亡明显增强,提示我们凋亡可能参与了血小板减少的机制。具体的作用机制还需要进行进一步的研究。第二部分免疫性血小板减少症患者血小板miRNA的表达谱检测及其靶分子鉴定研究背景与目的:免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是原因不明的由各种诱因引起的一种获得性自身免疫性出血性疾病。ITP发病机制尚未完全清楚,目前血小板减少被认为是自身抗体及T细胞介导的血小板破坏过多或产生过少。Mi RNA是一类高度保守的非编码单链小分子RNA,它能够通过核酸互补序列特异性的抑制靶m RNA翻译或诱导剪切,在转录水平上对基因的表达进行调控。大量研究表明,血小板中存在大量miRNA表达,miRNA不仅在维持血小板生物学功能中起重要作用,而且与多种疾病密切相关。目前,miRNA对ITP病人血小板功能的影响尚不清楚,血小板miRNA异常表达与ITP病人血小板数量减少是否相关少有报道。本研究通过高通量基因芯片技术分析ITP患者和正常对照者血小板中miRNA表达的差异,同时构建异常表达的miRNA与它们的靶基因的调控网络,以期探讨血小板miRNA在ITP发病中的作用。方法:分离22例ITP患者(ITP组)和8例健康体检者(对照组)外周血中的血小板,提取血小板中RNA,进行miRNA芯片检测,其中表达有统计学差异的部分miRNAs,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)进一步验证,生物信息学鉴定相对高表达(top 20)和低表达(top 20)的miRNAs的靶分子,并对其功能进行预测。结果:我们研究发现ITP组和对照中共有302种miRNA存在差异表达(P<0.05),其中65种miRNA只在ITP患者血小板中表达,而另有73种miRNA只在对照组中表达。生物信息学分析发现mi R-548a-5p,mi R-1185-2-3p,mi R-30a-3p,mi R-6867-5p,mi R-765和mi R-3125与血小板凋亡和粘附相关的基因密切相关。结论:上述结果说明ITP患者血小板中存在异常的miRNAs表达谱,且这些异常表达的miRNAs,其靶基因与细胞的粘附及凋亡等功能密切相关。miRNAs可能参与ITP疾病的发生,我们的研究可能为进一步研究ITP患者的发病机制奠定基础。第三部分免疫性血小板减少性症血小板中的长链非编码RNA表达谱分析研究背景与目的:免疫性血小板减少症作为一种器官特异性自身免疫性疾病,体内存在多种免疫异常,但其发病机制尚不清楚。目前认为ITP的发病是一个多步骤、多细胞参与的复杂过程。长链非编码RNA是一类转录本长度超过200个核苷酸、没有开放阅读框架,不编码蛋白质,但具有调控基因表达作用的RNA。研究表明Lnc RNA几乎参与细胞生命的每一个阶段,Lnc RNA通过各种分子机制在转录、翻译、染色质修饰、基因印记、蛋白质活性调控及RNA可变剪切调控等生物过程中发挥着重要调节作用。那么Lnc RNA是否也在ITP发病机制中发挥一定作用呢,这是本次研究我们想探讨的主要问题。随着以基因组表达谱芯片及转录组测序等为代表的高通量技术的不断进步和广泛应用,应用这些技术可以做到建立免疫性血小板减少症非编码转录数据库,寻找其与免疫性血小板减少症临床病理特征之间的关联,深入研究其功能。ITP与血小板凋亡密不可分,血小板中存在丰富的miRNA,可通过与凋亡相关蛋白相互作用参与血小板凋亡的调控,但其来源及表达调控方式尚不是很清楚。我们通过RNA-SEQ及生物信息分析发现血小板中存在大量Lnc RNA,部分以miRNA前体形式存在,那么Lnc RNA能否调控miRNA进而影响血小板凋亡?本次研究将为深入理解血小板凋亡调控机制,寻求通过抑制血小板凋亡以预防及治疗ITP的相关策略奠定理论基础。探讨血小板中的Lnc RNA是否以“miRNA前体”的形式自主调控血小板的生命活动,这一观点的提出与论证将为完善一个多通路、多层次的血小板基因调控网络奠定基础。方法:我们采用RNA-SEQ的方法分析ITP患者与正常对照血小板中Lnc RNA的表达差异,筛选出凋亡相关的Lnc RNA。对部分表达有统计学差异的Lnc RNA,采用实时荧光定量PCR进一步验证。通过与mi RBase比对寻找可作为miRNA前体的Lnc RNA,并与差异表达的miRNA进行关联分析;并采用q RT-PCR对Lnc RNA、miRNA及其靶向凋亡相关蛋白的表达情况进行验证,绘制Lnc RNA-miRNA-m RNA共表达图谱,探讨Lnc RNA在血小板凋亡中的作用机制。结果:相比正常对照组,43个Lnc RNA在免疫性血小板减少症组中显著性高表达,58个Lnc RNA显著性低表达。我们随机挑选了5个下调和5个上调表达的Lnc RNA,利用定量实时PCR技术对它们的表达进行检测。数据显示显示q RT-PCR和转录组测序结果相符。同时我们通过生物信息学结合实验验证,对差异表达的Lnc RNA进行了分析,筛选出可能与凋亡相关的Lnc RNA/miRNA/m RNA调控通路。进一步通过q RT-PCR实验发现ITP患者n382037高表达,同时伴有mi R-15/mi R-16上调,而其靶基因BCL2下调,但未检测到MCL1 m RNA。结论:上述结果说明Lnc RNAs可能参与ITP疾病的发生。在ITP患者血小板中可能存在凋亡相关n382037/mi R-15a、mi R-16/BCL2调控通路。高表达的Lnc RNA n382037可能通过上调血小板中mi R-16/mi R-15,从而抑制凋亡相关蛋白BCL2参与ITP血小板的凋亡。