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在细菌脂多糖(LPS)诱导的免疫反应中,髓样触发受体1(TREM1)的抑制将影响LPS的亲和性受体CD14基因的表达；脂多糖结合蛋白(LBP)的抑制将阻断LPS与CD14的结合路径。为了阐明布氏杆菌病发生相关基因信号转导机制,同时为利用RNA干扰技术培育抗布氏杆菌病转基因动物打下基础,本研究对抑制水牛TREM1基因和LBP基因表达的shRNA干扰序列进行了筛选。一、TREM1基因shRNA筛选与病毒感染水牛单核细胞的初步研究1.克隆水牛和黄牛TREM1基因mRNA ORF全长序列,构建水牛TREM1基因融合蛋白表达载体,并转染293细胞,通过RT-PCR方法检测水牛TREM1基因在293细胞中的表达。结果发现,克隆得到的水牛和黄牛的TREM1基因ORF序列,两者同源性为97.2%,重组质粒pDsRed-Nl-TREM1可在293细胞中表达。水牛TREM1基因序列成功提交到GenBank (JQ390222)。2.针对水牛TREM1基因CDS序列,设计5个shRNA片段并构建其慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shTREM96/194/294/578/643,同时以无关序列pSicoR-1864(N.C)作为阴性对照。PCR和测序鉴定后,将水牛TREM1表达载体(靶质粒)与其shRNA表达载体(干扰质粒)分别以1：1和1：3的比例经LipofectamineTM2000脂质体共转染293细胞,通过流式细胞仪和QRT-PCR方法检测shRNA抑制效率。结果发现,靶质粒与干扰质粒转染剂量比为1：1时,shTREM-194. shTREM-294和shTREM578抑制效率分别53.86%、49.27%和40.10%；1：3比例共转染时,抑制效率分别为63.07%、79.24%和31.14%。3.从水牛外周血中分离单核巨噬细胞,用TREM1shRNA慢病毒感染水牛单核巨噬细胞,通过QRT-PCR检测TREM1和CD14基因的表达。结果表明,分离纯化水牛单核巨噬细胞,可在体外培养1周；TREM1和CD14基因在巨噬细胞中均有表达,CD14基因的表达量高于TREM1的表达。在未经任何刺激情况下,shRNA病毒颗粒感染单核巨噬细胞的效率不高。二、LBP基因shRNA片段筛选1、克隆水牛和黄牛LBP基因,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并转染293细胞,通过QRT-PCR方法检测水牛LBP基因在293细胞中的表达。结果发现,分别克隆得到的水牛、黄牛LBP基因序列。二者同源性为98%。mRNA水平上检测到LBP基因在293细胞中可表达。水牛LBP基因成功提交到GenBank (JQ390223)。2.针对水牛LBP CDS序列设计2条shRNA序列,并构建其慢病毒表达载体,命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212, PCR和测序鉴定重组质粒,QRT-PCR检测shRNA的抑制效率。结果发现,将水牛LBP基因表达载体(靶质粒)与其shRNA表达载体(干扰质粒)以1：3的比例经LipofectamineTM2000脂质体共转染293细胞,shLBP-774, shLBP-1212抑制效率分别为49.53%,29.27%。以上结果表明,筛选得到3条抑制TREM1基因表达的shRNA序列shTREM194、shTREM294和shTREM578,其中shTREM194和shTREM294的抑制效率较高达到63.07%和79.24%。2条抑制LBP基因表达的shRNA序列shLBP774和shLBP1212,其中shLBP774的抑制效率最高达到49.53%。并分离纯化获得了水牛单核巨噬细胞。