背景在原发性肝癌中,肝细胞癌是主要的组织学亚型,占世界范围内总肝癌的70-85%,是发病率排第六位,致死率排第三位的癌症。在过去30年,对肝细胞癌的治疗尽管有明显改善,仍缺乏有效的预防措施,只有序贯疗法被临床认可用于早期肝细胞癌病人；然而,这种疗法的预后不佳,这主要归因于肝内转移极易复发。肝细胞癌治疗仍是一个医学难题,尤其是对于没有显著血管入侵,局部淋巴结或远端转移的早期肝细胞癌病人。慢性乙型肝炎病毒和/或慢性丙型肝炎病毒感染导致的肝纤维化和肝硬化是肝细胞癌的主要危险因素。全世界大约70-85%肝细胞癌是由于慢性乙型肝炎病毒或慢性丙型肝炎病毒持续感染所致。在部分亚洲和撒哈拉以南非洲,高频率肝细胞癌归因于升高的慢性乙型肝炎病毒感染流行。在这些区域,超过8%的人感染慢性乙型肝炎病毒。慢性乙型肝炎病毒感染导致肝癌发病人数与肝癌总发病人数相比,在发展中国家约占60%,在发达国家约占23%。慢性乙型肝炎病毒感染率,在发展中国家为33%,在发达国家为20%。在中国,乙型肝炎病毒感染也是肝细胞癌主要风险因素。慢性乙型肝炎病毒和慢性丙型肝炎病毒感染所致的持续的慢性炎症,导致肝硬化,并最终恶化为肝细胞癌。许多研究表明肝脏是脂类、脂蛋白类和载脂蛋白类代谢的关键器官,并且人类很多载脂蛋白是由肝脏产生。有研究表明,肝细胞癌病人血浆脂质成分异常。在肝细胞损伤和肝细胞癌迁移、侵袭、增殖等过程中,血浆脂质和脂蛋白发生改变。在慢性肝脏疾病和肝细胞癌中,血清脂类、脂蛋白类和／或载脂蛋白类水平可反映出肝细胞损伤程度。ApoM是近期发现的一种载脂蛋白,它主要与人类血浆中高密度脂蛋白相关联,也有少量出现在甘油三酯和低密度脂蛋白中。apoM主要表达在肝细胞和肾小管细胞中,也有一定程度表达于胎儿肝脏和肾脏。Jiang等人发现apoM在肝细胞癌病人血浆表达水平较正常受试者显著升高,但在肝细胞癌组织中的apoM的mRNA和蛋白质显著低于它们的癌旁组织。尽管进行了大量研究,apoM和肝细胞癌进展关系仍未阐明；肝细胞癌的潜在发病机制是否与apoM直接相关仍不清楚。在本研究中,我们发现apoM有显著的抗癌特性,可能通过抑制肝癌细胞的侵袭、迁移、增殖,并且可以通过抑制Bcl2A1表达从而促进肝癌细胞凋亡。此外,hsa-miR-573下调apoM表达,诱导Bcl2A1表达,减少癌细胞凋亡,促进裸鼠体内移植肿瘤的生长。目的1、观察apoM是否可以影响HepG2细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡。2、观察Hsa-miR-573是否可以影响apoM表达。 3、观察Hsa-miR-573是否可以影响HepG2细胞侵袭、迁移、增殖及细胞凋亡。4、观察Hsa-miR-573通过apoM是否可以影响HepG2细胞凋亡及相关机制研究。5、观察Hsa-miR-573和apoM是否可以影响其它肝癌细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡。6、通过裸鼠成瘤实验,观察hsa-miR-573和apoM是否可以影响肿瘤生长。7、在肝细胞癌病人中,血清apoM表达与其它诊断肝癌生化指标是否相关。方法1、观察apoM对HepG2细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的影响。1.1人类HepG2细胞从American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)获得,用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养,DMEM培养基包含10%胎牛血清、链霉素(100μg/mL)及青霉素(100 U/ml)。为了长期培养,每月对所有细胞株测试是否感染支原体。全部细胞在37℃,5%二氧化碳环境下孵育。细胞被种植于6孔板或12孔板或60毫米平皿,并且生长到铺满平皿达80-90%时待用。1.2人类HepG2细胞在含25cm2腔室细颈瓶中在标准培养条件(5%CO2,37℃)培养,其中含有DMEM培养基,伴有10%胎牛血清。慢病毒空载体标记绿色荧光蛋白(GFP; LV-Mock)和过表达人类apoM慢病毒载体(LV-apoM)标记GFP。在8 mg/mL聚凝胺条件下,细胞被慢病毒载体转染。孵育24小时后用新鲜的通用培养基清洗细胞。转导96小时后计数GFP阳性细胞。1.3收集转染LV-Mock和LV-apoM的人类HepG2细胞,制备蛋白质提取物。采用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质提取物,然后进行蛋白印迹分析,使用兔多抗-apoM抗体(Proteintech Group, Inc., Chicago, IL, USA),以及兔多抗-β-actin抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)。采用化学发光方法(ECL Plus Western Blot Detection System; Amersham Biosciences, Foster City, CA, USA)显示测定蛋白条带。1.4用Transwell小室(Millipore-Chemicon, Billerica, MA)进行侵袭实验和迁移实验。侵袭实验：将包被基质胶的小室放置于24孔组织培养皿中空孔中；用无血清培养基分别培养转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞24小时；然后用胰蛋白酶消化,用含有0.1%牛血清白蛋白的培养基稀释制成5×104cells/mL的细胞混悬液；之后,分别将500μL转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞混悬液加入每个小室；再将750μL完全培养基加入培养皿每孔中；孵育36小时后,用棉拭子将没有侵入细胞从小室隔膜上层去除；小室隔膜下层细胞用4%多聚甲醛固定10min,用结晶紫染色,然后通过显微镜摄制隔膜并计数。迁移实验：采用未包被小室,在孵育24小时后,将小室隔膜下层迁移转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞固定,染色然后摄制用于更进一步分析。1.5评估转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞的细胞增殖能力,采用细胞计数试剂盒-8(CCK8; Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)测量细胞生存能力。细胞分别转染慢病毒空载体和过表达apoM的慢病毒,分别种入96孔培养皿各三份。在不同时间点(0,12,24,36,and 48 h),将10μLCCK-8溶液分别加入培养皿中,并且在CO2培养箱中孵育1小时。然后,加入10μL1%(w/v)SDS溶液停止反应,通过酶标仪在450 nm(Thermo Electron Corporation, Marietta, OH,USA)处对培养皿进行读数。1.6收集转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞,采用配备氩离子激光器(488nnm)的FACScan流式细胞分类仪(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA)完成细胞周期分析和细胞凋亡定量。根据说明书,采用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology, Beijing, China)完成细胞周期分析。根据说明书,采用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I(BD Bioscience, MA)通过流式细胞分类仪完成细胞凋亡分析。2、观察Hsa-miR-573对apoM表达的影响。2.1根据试剂说明书用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取肝脏组织或培养细胞总RNA。根据试剂说明书用miRVana PARIS试剂盒(Ambion, Austin, TX, USA)从200μL血清中分离总RNA。启用靶点预测算法如miRBase、PicTar、 TargetScan和RNAhybrid,推测出apoM调节器有hsa-miR-145-5p、 hsa-miR-145-3p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-221-3p,、hsa-miR-222-5p、 hsa-miR-222-3p、hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573。根据说明书在20微升反应孔用All-in-OneTM miRNA qPCR试剂盒检测推测出的九种小RNA(miRNAs)调节器。采用实时PCR ABI 7500 Fast系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)进行实时PCR。以U6 RNA作为内参。为了分析血清hsa-miR-573,合成的spiked-in Caenorhabditis elegans miR-39提取之前加入血清标本作为内参RNA。采用ABI 7500快速实时PCR系统SYBR Green检测试剂(TaKaRa Bio, Inc., Shiga, Japan)通过实时定量PCR测定信使RNA水平。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参。采用△△Ct方法定量测量。所有标本测量三次,并且取平均值进行比较分析。2.2根据说明书用脂质体2000转染试剂,分别用50 nM miRNA模拟物(hsa-miR-145-5p, hsa-miR-145-3p, hsa-miR-221-5p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-222-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-766-5p, hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573)转染HepG2细胞48小时。所有实验对照样本给予等量浓度非靶向对照模拟物(阴性对照)。2.3人类apoM cDNA,包含hsa-miR-573靶点,通过化学合成,其中插入pMIR-REPORTM(Ambion)。以pMR-REPORTM beta-半乳糖苷酶对照(JAmbion)作为内参。荧光素酶测定中,采用脂质体2000转染试剂,野生型(pMIR-apoM-wt)或突变型(pMIR-apoM-mt)和hsa-miR-573模拟物共同转染进入人胚肾293T细胞(293T)。采用双重荧光素酶测试试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)测量荧光素酶活性。3、观察Hsa-miR-573对HepG2细胞侵袭、迁移、增殖和细胞凋亡的影响。3.1从ATCC获得HepG2细胞,采用DMEM培养,含10%胎牛血清、链霉素(100μg/mL)及青霉素(100 U/ml)。在37℃,5%二氧化碳环境下孵育。细胞在6孔板或12孔板或60毫米平皿中培养,生长至汇合度达80-90%时待用。为了长期培养,每月检测所有细胞株是否感染支原体。3.2在标准培养条件,含25 cm2腔室细颈瓶中培养HepG2细胞。慢病毒空载体标记GFP,过表达hsa-miR-573慢病毒载体(LV-miR-573)标记GFP。在8 mg/mL聚凝胺条件下,慢病毒载体转染细胞。孵育24小时之后用新鲜的通用培养基清洗细胞。转导96小时之后计数GFP阳性细胞。3.3收集转染LV-Mock及LV-miR-573的人类HepG2细胞,根据已建立的方法制备蛋白质提取物。采用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离出蛋白质提取物,进行蛋白印迹分析,采用兔多克隆抗-apoM抗体,以及兔多克隆抗-β-actin抗体。采用化学发光方法来显示测定蛋白条带。3.4采用Transwell小室进行侵袭实验及迁移实验。侵袭实验：将包被基质胶的小室放置在24孔组织培养皿中空孔中；采用无血清培养基分别培养转染LV-Mock和LV-miR-573人类HepG2细胞24小时；用胰蛋白酶进行消化,并且将含0.1%牛血清白蛋白培养基制成5×104 cells/mL细胞混悬液；然后,分别将500μL转染了LV-Mock和LV-miR-573的HepG2细胞混悬液加入到每个小室;750止完全培养基加入到培养皿每孔中；孵育36小时之后,使用棉拭子将没有侵人细胞从小室隔膜的上层细胞除去；小室隔膜的下层细胞用4%多聚甲醛固定10min,再用结晶紫染色,然后再通过显微镜摄制隔膜并计数。迁移实验：用未包被小室,孵育24小时后,固定小室隔膜下层迁移转染LV-Mock和LV-miR-573的人类的HepG2细胞,染色然后摄制用于再进一步的分析。3.5评估转染LV-Mock和LV-miR-573人类HepG2细胞的细胞增殖能力,用CCK-8测量细胞生存能力。细胞分别转染慢病毒空载体及过表达miR-573慢病毒,种入到96孔培养皿每种三份。在不同的时间点(0,12,24,36,and 48 h),将10μLCCK-8溶液加入到培养皿每孔中,并在一个CO2培养箱中孵育1小时。然后,将10 μL 1%(w/v) SDS溶液加入到每孔停止反应,通过酶标仪在光密度450nm(Thermo Electron Corporation, Marietta, OH, USA)下对培养皿进行读数。3.6收集转染LV-Mock和LV-miR-573的人类HepG2细胞,采用配备氩离子激光器(488 nm)的FACScan流式细胞分类仪来完成细胞周期分析及细胞凋亡定量。根据说明书,用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒完成对细胞周期分析。根据说明书,使用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I经过流式细胞分类仪来完成细胞凋亡分析。4、观察Hsa-miR-573通过apoM对HepG2细胞凋亡影响及相关机制研究。4.1从ATCC获得HepG2细胞,采用包含10%的胎牛血清、链霉素(100μg/mL)和青霉素(100 U/m1)的DMEM培养基进行培养。为了长期培养,每月对所有的细胞株测试是否感染支原体。细胞全部在37℃,5%二氧化碳环境下进行孵育。在6孔板或12孔板或60毫米平皿种植细胞,并且生长至汇合度达80-90%时待用。4.2用25 cm2腔室细颈瓶,在标准培养条件培养细胞,其培养基为含有10%胎牛血清的DMEM。慢病毒空载体标记GFP,过表达人类apoM慢病毒载体(LV-apoM)及过表达hsa-miR-573慢病毒载体(LV-miR-573)标记GFP。在8mg/mL聚凝胺条件下,慢病毒载体转染HepG2细胞。孵育24小时之后用新鲜培养基清洗细胞。转染96小时后计数GFP阳性细胞。4.3根据试剂说明书用TRIzol试剂提取转染了LV-Mock、LV-miR-573和LV-miR-573的人类HepG2细胞总RNA。采用ABI 7500快速实时PCR系统SYBR Green检测试剂(TaKaRa Bio, Inc., Shiga, Japan)通过实时定量PCR测定信使RNA水平。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参。采用△△Ct方法定量测量。所有标本测量三次,并且取平均值进行比较分析。HepG2细胞中分析相关基因的表达：CASP1, CASP2, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP8, CASP9, CASP10, P53, P63, P73, B-cell lymphoma (Bcl)-2, Bcl2-A1, Bcl2-L1, Bcl2-L2, Bcl-XL, Bcl-2对应拮抗剂(Bak), Bakl, Bcl-2相似蛋白4(Bax), Bik,髓细胞瘤病病毒致病基因同系物(c-myc), survivin和诱导髓细胞性白血病细胞分化基因(mcl-1)。4.4 PIRES2-EGFP和PCR-XL-TOPO(包含Bcl2A1,通过化学合成oligos经由PCR而组合)购于Invitrogen公司。Eco-RI-Bcl2A1和IRES-EGFP-XhoI部分通过CR-XL-TOPO和PIRES2-EGFP模板放大。采用重叠序列PCR,参与Eco-RI-Bcl2A1-IRES-EGFP-XhoI。凝胶电泳完成后,从凝胶上分离相关条带,采用EcoRI/XhoI双重酶切,合并入pcDNA3.1(+),然后转化进入有活性的大肠杆菌DH5a细胞进行更多地扩增和应用。重组质粒通过序列测定被证实并命名为pcDNA3.1-Bcl2Al。根据说明书采用脂质体2000转染试剂(Invitrogen公司)完成质粒转染实验。4.5将HepG2细胞处理如下：(1) LV-apoM, (2) LV-apoM+pcDNA3.1-Bcl2A1,(3) LV-miR-573, (4) LV-miR-573+pcDNA3.1-Bcl2A1。然后,收集细胞,根据已建立的方法制备蛋白质提取物。采用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质提取物,然后进行蛋白印迹分析,使用兔多克隆抗-apoM和抗-Bc12Al抗体(Proteintech Group, Inc., Chicago, IL, USA),以及兔多克隆抗-β-actin抗体。采用化学发光方法显示测定蛋白条带。4.6将HepG2细胞处理如下：(1) LV-apoM, (2) LV-apoM+pcDNA3.1-Bcl2A1,(3) LV-miR-573, (4) LV-miR-573+pcDNA3.1-Bcl2A1。然后,收集细胞,采用配备氩离子激光器(488 nm)的FACScan流式细胞分类仪完成细胞周期分析及细胞凋亡定量。按照说明书,用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒完成细胞周期分析。按照厂家说明书,采用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I通过流式细胞分类仪完成细胞凋亡分析。5、观察Hsa-miR-573和apoM对其它肝癌细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的影响。5.1从ATCC获得Hep3B细胞及SK-Hep-1细胞,使用含10%胎牛血清、链霉素(100μg/mL)和青霉素(100 U/ml)的DMEM培养基。为长期培养,每月对所有的细胞株测试是否感染支原体。在37℃,5%二氧化碳环境下培养细胞。将细胞种植于6孔板或12孔板或60毫米平皿,并且培养到汇合度达80-90%时待用。5.2在含25 cm2腔室细颈瓶中,标准培养条件下培养Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞。慢病毒空载体标记GFP,过表达人类apoM慢病毒载体及过表达hsa-miR-573慢病毒载体标记GFP。在8mg/mL聚凝胺条件下,慢病毒载体转染细胞。孵育24小时之后用新鲜培养基清洗细胞。转染96小时之后计数GFP阳性细胞。5.3收集细胞,根据已建立的方法制备蛋白质提取物。使用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白质提取物,再进行蛋白印迹分析,使用兔多抗-apoM抗体及抗-Bcl2A1抗体,以及兔多抗-β-actin抗体。采用化学发光显示测定蛋白条带。5.4用Transwell小室进行侵袭实验及迁移实验。侵袭实验：将包被基质胶小室放置在24孔组织培养皿中空孔中；采用无血清培养基分别培养转染了LV-Mock、 LV-apoM及LV-miR-573的Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞24小时；然后用胰蛋白酶消化,并且用含有0.1%牛血清白蛋白培养基稀释制成5×104cells/mL细胞混悬液；然后,分别将500μL转染LV-Mock、LV-apoM及LV-miR-573的Hep3B细胞或SK-Hep-1细胞混悬液加入到每个小室；再将750μL完全培养基加入到培养皿每孔中；培养36小时之后,用棉拭子将没有侵入的细胞从小室隔膜上层除去；小室隔膜下层细胞使用4%多聚甲醛固定10min,再用结晶紫染色,然后通过显微镜摄制隔膜并计数。迁移实验：用未包被小室,培养24小时后,将小室隔膜下层迁移转染LV-Mock、LV-apoM及LV-miR-573的Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞固定,染色然后摄制用于进一步分析。5.5评估转染LV-Mock、LV-apoM及LV-miR-573的Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞增殖能力,用细胞计数试剂盒-8测量细胞生存能力。细胞分别转染慢病毒空载体、过表达apoM慢病毒或过表达miR-573慢病毒,种入96孔培养皿各三份。于不同时间点(0,12,24,36,and48 h),将10 μL CCK-8溶液加入到培养皿每孔,在C02培养箱孵育1小时。然后,将10 μL 1%(w/v) SDS溶液加入每孔停止反应,通过酶标仪在光密度450 nm对培养皿进行读数。5.6收集转染了LV-Moc、LV-apoM或LV-miR-573的Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞,使用配备氩离子激光器(488 nm)的一个FACScan流式细胞分类仪完成细胞周期分析及细胞凋亡定量。按照说明书,使用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒完成细胞周期分析。根据说明书,采用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I,再通过流式细胞分类仪完成细胞凋亡分析。6、通过裸鼠成瘤实验,观察hsa-miR-573和apoM对肿瘤生长的影响。6.1所有研究依据南方医院实验动物管理委员会相关条款完成。无胸腺裸鼠(BALB/c,无特定病原等级,雄性,大约16 g,4周龄)被随机分为三组(LV-Mock(n=15)组,LV-apoM(n=15)组和LV-miR-573(n=15)组)；每个笼子饲养五只；饲养环境：25。C,每天12小时白天12小时晚上周期。所有小鼠用高压灭菌小鼠食物饲养。HepG2细胞用200此磷酸盐缓冲液混匀,接种剂量为每只小鼠1×107个HepG2细胞。LV-Mock组小鼠皮下注射对照慢病毒(LV-Mock), LV-apoM组小鼠皮下注射过表达apoM’慢病毒(LV-apoM), LV-miR-573组小鼠皮下注射过表达hsa-miR-573慢病毒(LV-miR-573)。所有裸鼠体重和移植性肿瘤每3天测量一次。全部小鼠处死后取出移植成形的肿瘤,并用石蜡包被。6.2收集移植肿瘤组织,根据已建立的方法制备蛋白质提取物。采用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质提取物,然后进行蛋白印迹分析,使用兔多克隆抗-apoM和抗-Bcl2A1抗体,以及兔多克隆抗-β-actin抗体。采用化学发光方法显示测定蛋白条带。6.3收集异种移植肿瘤中分离的肝细胞,采用配备氩离子激光器(488 nm)的FACScan流式细胞分类仪完成细胞周期分析和细胞凋亡定量。根据说明书,采用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒完成细胞周期分析。根据说明书,采用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I通过流式细胞分类仪完成细胞凋亡分析。7、在肝细胞癌病人中,血清apoM表达是否与其它诊断肝癌生化指标相关。7.1从2012年10月到2013年4月在南方医院医学实验中心获得655例血清标本。通过临床诊断结果,655例血清标本被分为4组：181例肝细胞癌病人血清,182例慢性乙型肝炎病人血清,63例慢性丙型肝炎病人血清,89例肝硬化病人血清,140例正常人对照血清。所有正常对照组的受试者氨基转移酶正常,无既往肝病史,无酗酒,未感染乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒。所有受试者特性有图表显示。7.2血清apoM浓度用商品化酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(USCN Life Science Inc., Wuhan, China)定量检测两次。用酶标仪(Titertek Multiskan MC, Sterling, VA, USA)在450纳米光密度下测量,采用apoM试剂盒制定标准线性回归曲线检测apoM溶度。丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)和甲胎蛋白(AFP)采用自动化分析仪测定。乙型肝炎表面抗原采用ELISA法检测。乙肝DNA浓度采用PCR仪检测。并分析血清apoM浓度和年龄之间的单变量相关性。7.3构建ROC曲线并计算曲线下面积,评估预示值的敏感性和特异性,评估血清apoM作为肝脏疾病恶化标志物的可行性。7.4应用以上健康志愿受试者、慢性乙型肝炎病人、慢性丙型肝炎病人、肝硬化病人和肝细胞癌病人血清,采用实时PCR ABI 7500 Fast系统进行实时PCR,验证hsa-miR-573表达。以U6RNA作为内参。分析血清hsa-miR-573时以合成的spiked-in Caenorhabditis elegans miR-39作为内参并在RNA提取之前加入血清标本。结果1.观察apoM对HepG2细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的研究。Jiang等人证明肝细胞癌组织中apoM mRNA和蛋白质水平显著低于癌旁组织。由于apoM涉及肝细胞癌发病机制,因此首先验证了apoM对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响。用慢病毒空载体(LV-Mock)或过表达人类apoM慢病毒载体(LV-apoM)转染HepG2细胞。通过蛋白印迹分析法评价HepG2细胞中apoM蛋白表达。与慢病毒空载体处理细胞组相比,过表达apoM的细胞apoM表达水平显著地升高。用transwell实验研究apoM对HepG2细胞迁移和侵袭的影响。与转染慢病毒空载体的HepG2细胞相比,感染过表达apoM慢病毒载体的HepG2细胞迁移和侵袭能力的显著减低。然后,观察采用CCK-8实验检测apoM的表达是否影响HepG2细胞的生存和增殖。结果表明,过表达人类apoM慢病毒载体处理,减低存活的HepG2细胞的比例。通过流式细胞术,研究apoM对细胞周期的影响。如图1D所示,与对照组相比,感染apoM后,在G1期细胞百分数有所增多,在S期细胞百分数有所减少,在G2期细胞和M期细胞百分数没有改变。通过流式细胞术,用联合标记钙磷脂结合蛋白V(AV)和碘化丙啶的方法,评价HepG2细胞感染慢病毒空载体和过表达人类apoM慢病毒载体后细胞凋亡情况。如图1E所示,与慢病毒空载体转染的HepG2细胞相比,转染过表达apoM’慢病毒载体显著增加细胞凋亡百分数(86.48±2.33 vs.3.31±0.56,p=0.000)。综上,这些数据表明apoM在肝细胞癌中的重要的病理学作用。2.观察Hsa-miR-573对apoM表达影响的研究。既然研究表明,与癌旁组织相比,肝细胞癌组织的apoM mRNA和蛋白质水平显著更低; miRNAs通过与靶向mRNAs的3’端非翻译区域相互作用,抑制基因表达。因此推测miRNAs可能参与apoM表达的调节。首先,用4个预测程序miRBase, PicTar, TargetScan和RNAhybrid去筛选靶向apoM的miRNAs。分析预测9个潜在的apoM-靶向的miRNAs,分别是:hsa-miR-145-5p、 hsa-miR-145-3p、 hsa-miR-221-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573。随后用HepG2细胞,研究九个假定的miRNAs模拟物对apoM表达的影响。hsa-miR-145-5p、 hsa-miR-145-3p、 hsa-miR-222-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573的模拟物下调apoM mRNA的表达。另外,hsa-miR-145-3p、 hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573的模拟物下调apoM蛋白表达。因此,hsa-miR-573模拟物显著下调apoM mRNA和蛋白质水平,且最低限度的自由能为-20.7 kcal/mol。采用荧光素酶实验研究,hsa-miR-573是否能直接调节apoM表达。在共转染hsa-miR-573和pMIR-apoM-野生型之后,荧光素酶活性显著地降低。如果把野生型换成突变型,这一效果完全消失。这些结果表明,hsa-miR-573通过直接靶向作用结合apoM的3’-UTR,抑制apoM的表达。3.观察Hsa-miR-573对HepG2细胞侵袭、迁移、增殖及细胞凋亡的研究。由于hsa-miR-573靶向作用于apoM,参与调节HepG2细胞的侵袭、迁移、增殖和凋亡。因此进一步研究了HepG2细胞中hsa-miR-573对侵袭、迁移、增殖和凋亡的效应。慢病毒空载体(LV-Mock)或过表达hsa-miR-573慢病毒载体(LV-miR-573)转染HepG2细胞。通过蛋白印迹法检测apoM蛋白在HepG2细胞中表达情况。与转染慢病毒空载体的细胞相比,转染过表达has-miR-573慢病毒的细胞apoM表达明显降低。Transwell实验发现,与转染慢病毒空载体HepG2细胞相比,转染慢病毒LV-miR-573的HepG2细胞迁移和侵袭能力显著地增强。CCK-8实验发现,慢病毒过表达LV-miR-573使HepG2细胞存活比例显著增强。此外,与转染慢病毒空载体对照组细胞相比,转染慢病毒LV-miR-573的HepG2细胞G1期(DNA合成前期)百分比减少,S期(DNA合成期)百分比增多,G2期(DNA合成后期)/M期(有丝分裂期)百分比不变。LV-miR-573显著抑制HepG2细胞凋亡率(3.65±0.49 vs.1.21±0.32,p=0.000)。这些结果表明,hsa-miR-573可能通过抑制apoM的表达从而促进HepG2细胞侵袭、迁移和增殖,并抑制HepG2细胞凋亡。4.观察Hsa-miR-573和ApoM对HepG2细胞凋亡影响及相关机制的研究。上述实验表明,在HepG2细胞中,与慢病毒空载体组相比,过表达apoM慢病毒组细胞凋亡率显著增强(86.48±2.33 vs.3.31±0.56,p=0.000)。因此进一步通过HepG2细胞中过表达apoM来研究apoM改变凋亡率的潜在机制。首先,在HepG2细胞中分析凋亡相关基因的表达：CASP1, CASP2, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP8, CASP9, CASP10, P53, P63, P73, B-cell lymphoma (Bcl)-2, Bcl2-A1, Bcl2-L1, Bcl2-L2, Bcl-XL, Bcl-2对应拮抗剂(Bak), Bakl, Bcl-2相似蛋白4(Bax), Bik,髓细胞瘤病病毒致病基因同系物(c-myc), survivin和诱导髓细胞性白血病细胞分化基因(mcl-1)。通过过表达apoM, CASP1和P63转录水平上调,反之,CASP6, CASP8, CASP9, P53, Bcl-2, Bcl2A1, Bak和Bik转录水平下调。在过表达apoM后,Bcl2A1明显下调,并且作为一个细胞内的膜相关蛋白,扮演重要的抑制凋亡的角色。通过蛋白印迹法,在慢病毒过表达apoM的HepG2细胞中,研究Bcl2A1蛋白的表达。过表达apoM导致Bcl2A1水平显著地下调。研究apoM是否通过抑制Bcl2A1表达诱导细胞凋亡；在HepG2细胞中,过表达apoM后,观察过表达Bcl2A1重组质粒(pcDNA-Bcl2A1)对细胞凋亡率的影响。在HepG2细胞中,pcDNA-Bcl2A1处理上调Bcl2A1蛋白表达。在HepG2细胞中,过表达人类apoM细胞凋亡率的增加可以被pcDNA-Bcl2A1处理代偿(85.76±1.96 vs.15.78±1.87,P=0.000)。在HepG2细胞中,通过蛋白印迹方法分析,研究hsa-miR-573是否调节Bcl2A1的表达,apoM是否参与这一过程。LV-miR-573诱导Bcl2A1蛋白表达。LV-miR-573转染所致的Bcl2A1表达的上调被过表达apoM恢复。另外,在HepG2细胞中,pcDNA-Bcl2A1处理显著地增强了LV-miR-573-抑制的细胞凋亡率(1.21±0.32 vs.0.23±0.06,p=0.000)。这些结果表明hsa-miR-573可能下调apoM的表达,上调Bcl2A1的表达。5.观察Hsa-miR-573和apoM对其它肝癌细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的研究。在Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞中,研究apoM对侵袭、迁移、增殖和细胞凋亡的影响。与慢病毒空载体处理的细胞相比,过表达miR-573细胞中apoM表达显著地减少,同时Bcl2A1表达显著地增加。此外,与慢病毒空载体处理的细胞相比,过表达人类apoM的细胞中Bcl2A1表达显著地降低。另外,与慢病毒空载体处理的细胞相比,过表达人类apoM细胞显示迁移、侵袭和增殖能力显著地降低。在Hep3B和SK-Hep-1细胞中,与慢病毒空载体处理相比,过表达人类apoM显著地增加细胞凋亡百分数(75.81±3.95 vs.2.95±0.91,p=0.000；83.56±5.13 vs.2.49±1.02,p=0.000)。如图5E所示,在Hep3B和SK-Hep-1细胞中,相比较对照组细胞,过表达人类apoM细胞G1期细胞百分数增加,S期细胞百分数减少,G2期/M期细胞百分数不变。以上结果表明,apoM在肝癌形成中扮演一个重要的角色。6.通过裸鼠成瘤实验,观察hsa-miR-573和apoM对肿瘤生长的影响。活体内实验评估hsa-miR-573和apoM对肿瘤生长的影响。皮下注射四周后,将肿瘤移除并称重。与注射慢病毒空载体处理的HepG2细胞的小鼠相比,注射过表达人类apoM慢病毒载体处理的HepG2细胞的小鼠,肿瘤生长显著地减慢(52.8% inhibition in weight, p=0.003);而注射过表达miR-573慢病毒载体处理的HepG2细胞的小鼠,肿瘤生长明显增快(24.7% promotion in weight, p=0.004).通过裸鼠成瘤实验,研究hsa-miR-573和apoM对Bcl2A1表达和细胞凋亡率的影响。采用蛋白印迹分析,检测apoM和Bcl2A1表达；采用流式细胞术,检测异种移植肿瘤分离的肝细胞的细胞凋亡比例。将过表达miR-573慢病毒载体处理的HepG2细胞,腹腔注射进入小鼠,所形成的异种移植肿瘤,通过蛋白印迹实验发现apoM蛋白表达下降,Bcl2A1蛋白水平升高。将过表达apoM慢病毒载体处理的HepG2细胞,腹腔注射进入小鼠,所形成的异种移植肿瘤,通过蛋白印迹实验发现,apoM蛋白表达升高,Bcl2A1蛋白水平降低。与注射慢病毒空载体处理的HepG2细胞的小鼠相比,注射过表达人类apoM慢病毒载体处理的HepG2细胞的小鼠,异种移植肿瘤分离的肝细胞的凋亡率显著地升高(75.81±3.95 vs.2.59±0.91,p=0.000)：反之,注射过表达miR-573慢病毒载体处理的HepG2细胞的小鼠,异种移植肿瘤分离的肝细胞的凋亡率显著地降低(0.31±0.06vs.2.59±0.91,p=0.000)。以上实验结果表明,apoM在肝细胞癌中起肿瘤抑制的作用。7.在肝细胞癌病人中,血清apoM表达与其它诊断肝癌生化指标相关性研究。研究apoM在肝细胞癌发病机理中所起的作用。在655个受试者中,研究血清apoM浓度与肝癌相关临床和生化指标相关性。在健康受试者、慢性乙型肝炎病人(CHB)、慢性丙型肝炎病人(CHC)、肝硬化病人和肝细胞癌病人中,平均血清apoM浓度分别为18.83±8.98 mg/L,21.36±12.63 mg/L,14.39±4.94 mg/L, 26.47±13.55 mg/L,and 23.59±13.64 mg/L。分析血清apoM浓度和年龄之间的单变量相关关系；血清apoM浓度分别和ALT、AST、AFP、HBsAg-T、HBV-DNA之间的单变量相关关系。在肝细胞癌受试者中,血清apoM浓度和AFP浓度显示一个正相关关系(r=0.470,p=0.025)。另外,与健康受试者相比,肝细胞癌病人、慢性乙型肝炎病人和肝硬化病人,血清apoM水平显著地升高,然而慢性丙型肝炎病人,血清apoM水平显著地降低。在655个已鉴定的受试者(包括182个慢性乙型肝炎病人、63个慢性丙型肝炎病人、89个肝硬化病人和181个肝细胞癌病人)研究apoM的预测值。分析ROC曲线发现,与慢性乙型肝炎病人相比,健康对照受试者apoM的曲线下面积为0.524±0.032(95% confidence interval(CI)=0.462-0.587,p=0.453)；与慢性丙型肝炎病人相比,健康对照受试者apoM的曲线下面积为0.685+0.034(95%CI=0.596-0.741,p=0.000)；与肝硬化病人相比,健康对照受试者apoM显示的曲线下面积为0.687±0.034(95%CI=0.595-0.731,p=0.000)；与肝细胞癌病人相比,健康对照受试者apoM的曲线下面积为0.712±0.031(95%CI=0.615-0.738,p=0.000)。用上述健康志愿受试者、慢性乙型肝炎病人、慢性丙型肝炎病人、肝硬化病人和肝细胞癌病人血清,研究血清hsa-miR-573表达。与健康志愿受试者相比,慢性丙型肝炎病人的血清hsa-miR-573表达显著地上调。此外,与健康志愿受试者相比,慢性乙型肝炎病人、肝硬化病人和肝细胞癌病人的血清hsa-miR-573表达水平显著地下调。结论1、ApoM抑制HepG2细胞迁移、侵袭和增殖,同时促进细胞凋亡。2、通过靶向作用apoM的3’-UTR,Hsa-miR-573下调apoM的表达。3. Hsa-miR-573促进HepG2细胞侵袭、迁移和增殖,同时抑制凋亡。4、通过调节Bcl2A1表达,apoM促进HepG2细胞凋亡,hsa-miR-573抑制HepG2细胞凋亡。5、在其它的肝癌细胞系,ApoM抑制细胞侵袭、迁移和增殖,同时促进细胞凋亡。6、在裸鼠成瘤实验中,ApoM抑制肿瘤生长,反之hsa-miR-573促进肿瘤生长。7、在肝细胞癌病人中,血清apoM浓度升高,并且显示和AFP浓度呈正相关。