一研究背景蛋白质组学(proteomics)是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。与传统蛋白质研究方法比较,蛋白质组学研究能提供更多的生命信息,发现和理解生命活动的规律,以及生理、病理现象的本质。蛋白质组学研究方法已广泛应用于基础及临床的各相关领域,如细胞生物学、神经生物学、肿瘤学及心血管病等各种学科领域。早发冠心病是指发病年龄男性小于55岁,女性小于65岁的冠心病,是一种特殊的冠心病类型。近年来国内外研究表明早发冠心病有增多的趋势,其冠状动脉病变发生早或者病程发展迅速,值得引起重视。冠心病是环境与遗传等多种因素共同参与的疾病,在冠心病所有的危险因素中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低是独立的的危险因素之一,无论低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平如何,HDL-C均与冠心病和中风的发病率呈反比。但是,血浆HDL-C的测定是一种比较笼统的评价HDL心血管保护作用的指标,因为HDL颗粒中蛋白质的种类和含量有很大的差异,导致HDL的作用如胆固醇逆转运、抗氧化、抗炎作用均有较大差异。因此确定HDL中蛋白质种类和含量对准确评价HDL的心血管保护作用具有很重要的作用。将蛋白质组学的技术和方法应用于HDL研究中,分析HDL的组成、功能以及不同疾病状态下HDL内蛋白质表达的差异是近年来研究HDL的新策略,而且已有的研究多为HDL蛋白质组成方面的研究,针对HDL蛋白质含量的差异的研究很少,国内暂无此方面的研究。本研究以确诊冠心病的年龄小于45岁为判断早发冠心病的年龄指标,应用差异蛋白质组学技术分析早发冠心病患者HDL中表达有差异的蛋白质,并通过并在一个大样本验证并观察差异蛋白质对早发冠心病发病的影响。二研究内容第一部分早发冠心病患者的临床、生化和冠脉造影特点研究目的本研究通过将早发冠心病患者与老年冠心病及年龄相匹配的健康对照组比较,探讨早发冠心病的临床、生化和冠脉造影特点。研究方法1.研究对象：(1)为2008年11月至2009年6月就诊于北京阜外心血管病医院的患者423例,所有患者均有完整的病历资料及冠状动脉造影结果。(2)早发冠心病患者109例(41.7±4.92岁),其中76例患者无心梗病史并且未服用他汀类及其他降脂类药物；(3)老年冠心病为发病年龄大于55岁的患者；共238例(60.5±8.15岁),其中92例患者无心梗病史并且未服用他汀类及其他降脂类药物；(4)对照组为76例(40.6±5.9岁)与早发冠心病组年龄相匹配的健康人,其中45例为怀疑冠心病但冠脉造影正常的患者,31例为体检排除冠心病患者,检查项目包括：全面体格检查、静息心电图、活动平板心电图、血生化及血常规、任何可疑冠心病、严重肝肾疾病及感染性疾病均从本研究中排除。2.观察指标：(1)人口学特征：年龄、性别、体重指数；(2)体重指数：吸烟史、高血压病史、糖尿病病史、早发冠心病家族史及心梗史；(3)实验室指标指标：甘油三脂(Triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、载脂蛋白A-I(apoliopoprotein A-I, apoA-I)、脂蛋白(a) (lipoprotein (a),LP(a))、尿酸(Uric acid)和高敏c反应蛋白(high-sensitive C-reactive protein,hsCRP);(4)冠状动脉造影特点：病变血管数量,各支冠脉病变的比率及冠脉狭窄程度的比较；研究结果1.与健康对照组相比,早发冠心病组中吸烟史、冠心病家族史、高血压及糖尿病史显著升高(p<0.05)；HDL-C、apoA-Ⅰ含量显著降低,而TG、LP(a)和hsCRP水平升高(p<0.05)。2.与老年冠心病组相比,早发冠心病组急性心肌梗死的发生率明显升高(p<0.05),早发冠心病常累及单支血管,而Gensini评分无显著性差异；血清HDL-C和hsCRP低于老年患者组。研究小结1. HDL-C及apoA-Ⅰ在早发冠心病组显著降低,可能与早发冠心病发病有关；2.吸烟、糖尿病、高血压、冠心病阳性家族史可能与早发冠心病发病有关；3.早发冠心病的hsCRP明显高于健康对照组及老年冠心病组,但本研究种还不能用hsCRP作为评价冠脉狭窄程度的指标,需要进一步扩大样本量进行验证；4.早发冠心病常累及单支冠状动脉,但LAD、LCX、RCA累及率及冠脉狭窄程度与老年患者无明显差异；第二部分早发冠心病患者HDL的差异蛋白质组学分析研究目的分析HDL蛋白质组成,并通过比较早发冠心病患者与健康对照组HDL组成成分含量的差异,探讨HDL内表达有差异的蛋白质对早发冠心病的影响,并探讨是否可以作为早发冠心病发病的生物标记物。研究方法1.研究对象：两组人群均为2008年11月至2009年6月就诊于北京阜外心血管病医院的患者(n=90)。所有入选患者均为男性。第一组人群(15例年龄匹配的健康对照和15例早发冠心病患者)血浆标本分离HDL,用荧光胶内差示电泳(Two-dimensional difference in-gel electrophoresis,2D DIGE)进行HDL差异蛋白质组学分析。第二组人群(30例年龄匹配的健康对照和30例早发冠心病患者)的血浆标本用免疫学方法验证蛋白质组学结果。2.观察指标：(1)观察我国健康人HDL蛋白质组成；(2)观察早发冠心病和健康对照组HDL之间蛋白质含量的差异；(3)用Western及ELISA验证蛋白质组学发现的差异蛋白质；研究结果1.本研究中应用超速离心法分离HDL,采用Beckman Coulter IMMAGE免疫分析系统测定HDL中apoB脂蛋白含量,证实HDL样品中不含apoB的污染。2.线性离子阱质谱(LTQ-FT)证实健康对照组HDL是由40种蛋白质组成的蛋白质复合体,根据GO anylasis分析软件进行功能分类可以分为脂质代谢和转运相关蛋白类、炎症相关蛋白、具有酶活性蛋白及其它参与细胞代谢的蛋白；而早发冠心病组HDL由34种蛋白质组成,脂质代谢相关的蛋白质种类两组无明显差别,主要为非载脂蛋白类的减少。3.荧光胶内差示电泳(2D DIGE)结束后,分别用相应波长对Cy2, Cy3, Cy5荧光扫描,DeCyder 5.0软件处理,发现表达有差异的蛋白质点。与年轻健康对照组比较,早发冠心病组有5个蛋白质点表达明显升高,15个表达降低,并对其中11个表达量较高的点进行了质谱鉴定,共鉴定出4种蛋白质：早发冠心病组表达升高的蛋白质为A-SAA和apoL1,表达降低的为apoA-Ⅰ和apoA-Ⅳ。4. Western及ELISA方法证实HDL及血浆中apoA-Ⅰ、apoA-Ⅳ和SAA变化趋势与2D DIGE结果一致。研究小结1.线性离子阱质谱(LTQ-FT)证实健康对照组HDL是由40种蛋白质组成的蛋白质复合体,可以分为脂质代谢和转运相关蛋白类、炎症相关蛋白、具有酶活性蛋白及其它参与细胞代谢的蛋白；2.HDL可以作为某些蛋白质在血液循环中的载体,早发冠心病患者HDL中蛋白质种类少于健康对照组,主要为非载脂蛋白种类的减少,说明早发冠心病患者HDL运输载体的功能降低,但HDL中蛋白质种类的变化是否影响HDL的功能,以及蛋白质种类的改变是否参与动脉粥样硬化的发生发展过程还需进一步的研究。3.通过2D DIGE及MALDI-TOF MS技术,我们鉴定出了一系列在早发冠心病HDL内表达有差异的蛋白质,其中,apoA-Ⅰ, apoA-Ⅳ和SAA有可能与早发冠心病发病有关。4.HDL及血浆中apoA-Ⅰ、apoA-Ⅳ和SAA变化趋势与2D DIGE结果一致,因此可以用血浆中对应蛋白质的含量评价其对早发冠心病的影响。(三)HDL相关的心血管病危险因素对早发冠心病的诊断价值分析研究目的观察HDL-C相关因子apoA-Ⅰ、apoA-Ⅳ、apoE和血浆淀粉样蛋白A(SAA)对冠心病的影响,并通过回归模型及ROC曲线评价联合应用各种因子对冠心病诊断的价值。研究方法1.研究对象：119例患者均为2008年11月至2009年4月就诊于北京阜外心血管病医院的患者,其中,60例心绞痛患者冠脉造影显示至少一支冠脉血管狭窄大于50%,59例年龄、性别匹配的非冠心病患者为对照组。2.观察指标：(1)用免疫散射比浊法测定血浆中apoA-Ⅰ及apoB含量。(2)用ELISA测定血浆中apoA-Ⅳ、apoE及SAA含量。(3) Logistic回归逐步分析对早发冠心病的诊断筛选变量,求出Logistic回归方程,并在SPSS的工作数据表中产生含各个体预测概率的新变量。使用SPSS的ROC曲线分析,以新变量为检验变量,以冠脉造影结果为状态变量,将新变量与单个指标的ROC曲线作比较并求出诊断点。研究结果1.与对照组相比,早发冠心病患者血浆apoA-Ⅰ, apoA-Ⅳ含量降低,而SAA, hs-CRP含量明显升高,apoB及apoE含量虽高于对照组但未有统计学意义。2.Logistic回归分析剔除对早发冠心病发病无显著性影响的变量后,得出早发冠心病发病的概率预报模型：P=I／[1+e-(2.267-4.868·apoA-I+1.889·SAA-4.897·HDL-C+0.694·hsCRP)],并在SPSS工作表中产生各个体预测值的另一组新变量Pre-1 (predicted probability-1)。3.以新变量Pre-1为检验变量,以冠脉造影结果为金标准,作ROC曲线分析,得出各检验变量的曲线下面积最大,说明此新变量对早发冠心病预测敏感度和特异性较高。4.选择Youden指数最大的截断点对应的界值作为早发冠心病的诊断标准,得出新变量Pre-1诊断点为0.468。当Pre-1取值为0.468时,其对早发冠心病的诊断的灵敏度及特异度分别为82.46%和84.75%。研究小结1.分别以apoA-Ⅰ、apoA-Ⅳ、SAA、hs-CRP和Pre-1为检验变量,以冠脉造影结果为金标准,作ROC曲线分析比较,Pre-1的曲线下面积最大,说明此新变量对早发冠心病预测敏感度和特异性较高。2.新变量Pre-1对早发冠心病诊断截断点为0.468。当Pre-1取值为0.468时,其对早发冠心病的诊断的灵敏度及特异度分别为82.46%和84.75%。3.本研究为较小样本的初步性研究,应该在更大样本量对预测模型进行验证和完善。三研究结论1.健康对照组HDL是由40种蛋白质组成的复合体,为HDL的生物学功能的多样性提供了研究基础。2.早发冠心病组HDL由34种蛋白质组成,与健康对照组比较,主要为非载脂蛋白种类的减少,说明早发冠心病患者HDL运输载体的功能降低。3.荧光胶内差示电泳(2D DIGE)提示早发冠心病患者有4种蛋白质表达出现差异：A-SAA和apoL1表达升高,apoA-Ⅰ和apoA-Ⅳ表达降低。4.血浆中apoA-Ⅰ、apoA-Ⅳ和SAA含量变化与HDL中相应蛋白质的变化趋势一致提示血浆apoA-Ⅰ、apoA-Ⅳ和SAA的变化可能成为评价早发冠心病的候选生物标记物。5.通过测定HDL-C、apoA-Ⅰ、SAA和hsCRP等指标转化为一个参数Pre-1,利用Pre-1预测、诊断早发冠心病,有可能能提高诊断灵敏度及特异度,为早发冠心病诊断及预防提供更为可靠的实验室依据。6.选择Pre-1的ROC曲线Youden指数最大的截断点对应的界值作为早发冠心病的诊断标准,当Pre-1取值为0.468时,其对早发冠心病的诊断的灵敏度及特异度分别为82.46%和84.75%。