论文部分内容阅读
非酒精性脂肪肝病是指在无过量酒精摄入的情况下所引起的肝细胞脂肪变性的临床肝脏病理性综合症。非酒精性脂肪肝病不仅会导致肝脏发生病理性变化,同时也会引起人体的代谢紊乱和心血管等方面的疾病。但鹅肥肝在严重脂肪堆积的情况下不出现明显的病理变化,提示其存在某种保护机制。前人研究发现,鞘脂类物质（鞘磷脂、神经酰胺、鞘氨醇等）与肝脏疾病的发生和发展过程密切相关。已知胆胺可通过生成CDP-胆碱参与鞘脂类物质代谢,神经酰胺和鞘氨醇作为炎症诱发因子参与了哺乳动物非酒精性脂肪肝病的发生与发展,进而影响脂肪肝形成过程中的炎症反应。前期研究结果显示,填饲组朗德鹅肝脏中胆胺和鞘氨醇的含量显著低于对照组,而鹅不仅具有胆碱激酶（CHKA,CHKB）,还具有胆胺激酶（ETNK1,ETNK2）,更重要的是,与正常肝脏相比,鹅肥肝中的炎症反应标志物TNF-α和MCP-1的mRNA和蛋白表达水平均受到显著抑制。据此推断在鹅肥肝形成过程中,通过生成CDP-胆碱促进神经酰胺、鞘氨醇向鞘磷脂转化,减少肝脏中促炎因子神经酰胺和鞘氨醇的含量,从而抑制高度脂肪堆积所引起的炎症反应。本研究首先在鹅活体（非炎症模型）中通过填饲得到鹅肥肝,验证胆胺在鹅肥肝中的作用,然后在细胞水平（鹅原代肝细胞、HepG2细胞）上研究胆胺对炎症反应的调节作用以及抑制炎症反应的作用机制,最后在高脂诱导的小鼠脂肪肝（炎症模型）中进一步研究胆胺对小鼠脂肪肝炎症的抑制作用。主要研究结果如下:（1）鹅肥肝中胆胺衍生物和鞘脂物质含量与炎性因子表达的关联将30只70日龄朗德鹅公鹅随机分为对照组与填饲组。与对照组相比,填饲组鹅的体重、肝重以及腹脂重显著增加（P＜0.05）;荧光定量PCR检测后发现,填饲组朗德鹅肝脏中的TNF-α和MCP-1的mRNA表达量显著降低（P＜0.05）;填饲朗德鹅肝脏中神经酰胺含量减少,鞘磷脂与CDP-胆胺的含量增加。结果提示胆胺可能通过调控CDP-胆胺的生成参与鞘脂代谢,减少神经酰胺与鞘氨醇的含量,抑制鹅肥肝形成过程中炎症的发生。（2）胆胺在CHKA的作用下参与鞘脂物质生成抑制鹅原代肝细胞中炎症的发生分离并培养22d的朗德鹅胚胎原代肝细胞。利用棕榈酸诱导鹅原代肝细胞建立非酒精性脂肪肝病模型,在模型细胞中添加胆胺。结果发现,在1 mM浓度的棕榈酸诱导下,鹅原代肝细胞中TNF-α和MCP-1的表达量显著升高（P＜0.05）,而添加胆胺之后,TNF-α和MCP-1的mRNA与蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;通过siRNA沉默CHKA基因的表达后,添加胆胺对TNF-α和MCP-1的mRNA与蛋白的表达无显著影响（P＞0.05）;在细胞模型中鞘氨醇与神经酰胺的含量显著升高,添加胆胺会使神经酰胺与鞘氨醇的含量显著降低（P＜0.05）,鞘磷脂的含量显著升高（P＜0.05）;当CHKA基因被沉默之后,再添加胆胺,与对照组相比,神经酰胺、鞘氨醇与鞘磷脂的含量无显著变化（P＞0.05）。结果表明在鹅原代肝细胞中,胆胺在CHKA的作用下参与鞘脂物质合成,抑制非酒精性脂肪肝病炎症的发生。（3）胆胺在CHKA的作用下参与鞘脂物质生成抑制HepG2细胞中炎症的发生通过荧光定量PCR检测棕榈酸诱导的HepG2细胞中的TNF-α和MCP-1的mRNA表达量,结果发现,用浓度为0.125 mM和0.25 mM的棕榈酸诱导HepG2细胞可以使TNF-α和MCP-1的mRNA表达量显著升高（P＜0.05）,添加胆胺之后,TNF-α和MCP-1的mRNA表达量无显著变化（P＞0.05）;与棕榈酸+胆胺组相比,当CHKA基因被沉默时,添加胆胺后,细胞中的神经酰胺、鞘氨醇与鞘磷脂的含量无显著变化（P＞0.05）。结果表明,在棕榈酸诱导的HepG2细胞中,胆胺在CHKA的作用下参与鞘脂代谢的合成,抑制HepG2细胞炎症的发生。（4）在小鼠高脂日粮中添加胆胺能抑制肝脏炎症的发生利用高脂日粮诱导小鼠建立非酒精性脂肪肝病模型,通过在高脂日粮中添加胆胺,检测相关指标。结果显示,与对照组相比,高脂组的体重、肝脏与腹脂重显著升高（P＜0.05）;与高脂组相比,添加胆胺的3组体重、肝脏与腹脂重显著降低（P＜0.05）;通过检测小鼠的血糖耐受性、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量及肝脏组织切片发现,高脂组小鼠的肝脏损伤增加,添加胆胺的3组试验小鼠无明显的肝损伤;与对照组相比,高脂组肝脏组织中TNF-α和MCP-1的mRNA与蛋白表达显著升高（P＜0.05）;与高脂组相比,添加胆胺的3组肝脏组织中TNF-α和MCP-1的mRNA与蛋白表达显著降低（P＜0.05）;与对照组相比,高脂组小鼠肝脏中神经酰胺与鞘氨醇的含量显著升高（P＜0.05）,神经酰胺与CDP-胆碱的含量显著降低（P＜0.05）,与高脂组相比,添加胆胺的3组中神经酰胺与鞘氨醇的含量显著降低（P＜0.05）,神经酰胺与CDP-胆碱的含量显著升高（P＜0.05）;与高脂组相比,添加胆胺组中的CHKA,ETNK1与ETNK2基因的mRNA表达量显著升高（P＜0.05）,ASAH1和CERS1基因的mRNA表达量显著降低（P＜0.05）。结果表明,在小鼠的高脂日粮中添加胆胺,会激活胆胺参与鞘脂代谢的作用,抑制炎症的发生;胆胺在CHKA作用下参与鞘脂代谢,通过促进神经酰胺和鞘氨醇向鞘磷脂转化而抑制炎症的发生。综上所述,在动物机体内胆胺在CHKA的作用下生成CDP-胆碱促进神经酰胺与鞘氨醇向鞘磷脂转化,减少肝脏中神经酰胺和鞘氨醇的含量,抑制炎症的发生。