论文部分内容阅读
目的:氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)是人体肝脏代谢中不可缺少的酶,存在于肝线粒体中,是催化尿素循环第一步反应的限速酶。CPS1基因异常和肝细胞癌有着密切的关系。肝细胞谱系基因的调控主要是在转录水平,各种肝富集转录因子(LETFs)或异源物核受体起着至关重要的作用。然而有关肝细胞尿素代谢通路关键酶低表达的启动子研究还较少,CPS1表观遗传调控涉及启动子分析以及LETFs在其中所起的作用尚未完全阐明。为此本研究以CPS1基因启动子为对象,研究肝富集转录因子与CPS1转录调控之间的关系。方法:构建CPS1全长启动子重组质粒,并与各种LETFs分别共转染,双荧光素酶报告基因检测LETFs与CPS1启动子转录的关系。进一步构建CPS1启动子各截短片段重组质粒,并将得出的正向调控转录因子分别与各截短片段进行瞬时转染,检测各片段荧光活性变化。运用转录因子结合位点预测软件对活性正向变化最明显的区域进行位点预测,并构建位点突变重组载体,转染,检测荧光活性变化。针对该位点合成生物素探针和引物,分别进行EMSA和Ch IP实验,体内体外验证其存在性。转录因子的过表达与干扰双重验证其与CPS1基因转录活性的关系,并结合蛋白水平和m RNA水平加以证明。最后,肝源性细胞尿素生成量的检测来进一步证明转录因子与CPS1基因表达调控关系。结果:LETFs分别共转染全长启动子重组质粒p GL4-2086于Hep G2和BEL-7404细胞中,双荧光素酶报告基因检测发现两种细胞中CPS1转录活性在转染了转录因子HNF3β后均发生显著的提高。之后HNF3β分别与各个截短片段转染,双荧光活性检测得出截短片段p GL4-70组在转染之后明显增强,说明在-70nt~+73nt中可能存在着至关重要的HNF3β结合位点。对-70nt~+73nt进行结合位点软件预测,找到两个综合评价高的位点,并设计突变引物构建突变载体,两个突变载体和正常的p GL4-70分别转染于Hep G2中,双荧光素酶活性检测发现结合位点2对应的p GL4-70-HNF3βmut2荧光活性相比于p GL4-70有明显降低,充分表明结合位点2是有效存在的。针对位点2合成探针和引物后,EMSA实验发现加入了生物素探针的条带出现明显的凝胶阻滞现象,添加了转录因子特异性抗体的条带更是被超级阻滞,加入了冷探针的条带有明显的竞争作用,而突变探针无此竞争作用;Ch IP发现加入了特异性抗体的实验组扩增的条带与Input组相近,而阴性对照和不加抗体组均无扩增条带。EMSA和Ch IP的结果证实了HNF3β与CPS1基因在体内、体外起相互作用。HNF3β的过表达与干扰实验发现CPS1启动子的荧光活性随着p FLAG-HNF3β的过表达而增加,呈现出浓度依赖性。共转染HNF3βsi RNA组的荧光强度明显低于阴性对照NC组。此外,CPS1在蛋白水平和m RNA水平也表现出相同的趋势。最后,尿素生成实验中,随着NH4CL浓度的增加,Hep G2和BEL-7404两种细胞分别共转染p FLAG-HNF3β后的尿素量均有不同程度的增加,表明转录因子HNF3β可以通过调节CPS1的表达来促进氨的代谢。结论:(1)CPS1和HNF3β都具组织特异性,在肝源性细胞中表达水平明显高于非肝细胞。(2)肝富集转录因子HNF3β与CPS1转录调控密切相关,HNF3β促进CPS1转录并使CPS1基因表达增强。(3)HNF3β通过调节CPS1的表达来促进氨的代谢,有希望为构建新型氨解毒功能肝细胞提供合适的靶点。