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椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration,IDD）在临床上较常见,易造成腰椎间盘突出、盘源性腰痛及椎体滑脱等问题,导致后期反复的慢性疼痛,严重影响患者的日常生活和工作,给社会带来沉重的经济负担。据估算,美国一年用于治疗相关疾病的费用高达900亿美元[1]。目前IDD缺乏有效的临床治疗措施,多以保守治疗改善症状为主[2]。超声波是常用的康复物理因子之一,因安全、无创、有效、方便等优点,在临床广泛应用。目前低强度脉冲超声（Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS）治疗主要用于软组织损伤及促进骨折愈合[3],对其在IDD防治中的作用研究较少。新近研究发现,LIPUS可上调大鼠损伤椎间盘的II型胶原（Collagen2,Col2）表达,并下调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因水平,提示其可能对IDD有一定的缓解作用[4]。本研究中,我们采用三种不同强度的LIPUS处理大鼠髓核（Nucleus pulposus,NP）细胞系及小鼠退变的椎间盘,发现LIPUS能上调大鼠NP细胞系的蛋白聚糖（Aggrecan,Acan）及细胞骨架等相关基因的表达,并可减轻针刺所致尾椎间盘的退变程度,为IDD的超声治疗提供了实验基础。研究方法第一部分:1.采用频率为3MHz、占空比为50%的三种不同强度（0.1W/cm2、0.5W/cm2、1.0W/cm2）LIPUS处理大鼠NP细胞系,细胞划痕实验观察不同时间点（0h、6h、10h）NP细胞迁移的情况。2.采用频率为3MHz、占空比为50%的三种不同强度（0.1W/cm2、0.5W/cm2、1.0W/cm2）LIPUS处理大鼠NP细胞系,EdU掺入法检测处理4h后的NP细胞增殖的情况。3.培养大鼠NP细胞系,采用频率为3MHz、占空比为50%的三种不同强度（0.1W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2）LIPUS对其行处理,通过实时荧光定量PCR检测细胞外基质Acan,Col2,波形蛋白（Vimentin）、层粘连蛋白a（Laminin a）等细胞骨架蛋白的mRNA基因表达水平,在正常环境下筛选最佳超声治疗强度。4.采用浓度为10ng/ml IL-1β预处理大鼠NP细胞24小时,模拟炎性环境,采用频率为3MHz、占空比为50%的三种不同强度（0.1 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2）LIPUS对NP细胞进行处理,通过实时荧光定量PCR检测Acan、Vimentin、Laminin a、金属基质蛋白酶13（Matrix metalloproteinase-13,MMP13）等相关基因的mRNA表达水平,发现最佳超声治疗强度。第二部分:1.小鼠针刺尾椎IDD模型的建立:通过采用型号为26G和30G的针,在X光定位下针刺小鼠尾9/10椎间盘,不同时间点进行组织学切片,臧红固绿、FAST及阿尔新蓝&H.E.染色,观察小鼠IDD的情况,选择合适的针具建立稳定的IDD模型。2.将小鼠分为对照组、针刺组及超声组（n=10）,采用强度为0.5 W/cm2、频率为3MHz、占空比为50%的LIPUS对损伤1周后的小鼠尾椎间盘,处理2周,通过阿尔新蓝&H.E.染色,分别对NP、纤维环（Annulus fibrosus,AF）及椎间盘进行评分,观察LIPUS对针刺所致IDD进程的影响。3.免疫组织化学法染色观察针刺组及超声组的小鼠尾椎间盘Col1、Col2、Acan、MMP13等基质稳态维持相关蛋白表达,从组织学角度观察LIPUS对IDD的影响。实验结果1.LIPUS能够促进大鼠NP细胞的增殖及迁移1.1超声处理6h后,强度为1.0W/cm2 LIPUS处理组的大鼠NP细胞迁移较空白组有显著的统计学差异;而在处理10h后,强度为0.5W/cm2及1.0W/cm2 LIPUS处理组的大鼠NP细胞迁移均明显快于空白组。1.2三种强度（0.1 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2）的LIPUS处理4h后,EdU阳性细胞率均较空白组明显增加,其中强度为0.5W/cm2和1.0W/cm2超声促增殖能力较0.1W/cm2更强。2.LIPUS能够在正常环境及炎性刺激下,促进大鼠NP细胞相关基因的表达2.1在正常环境下三种强度（0.1 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2）的LIPUS处理组均能上调NP细胞Col2、Acan、Vimentin、Laminin a mRNA的表达量。其中强度为0.5W/cm2和1.0 W/cm2的LIPUS处理组明显上调了Vimentin、Laminin a的表达。而Col2、Acan的相对表达量则在强度为0.5W/cm2的LIPUS处理组表达最高。2.在IL-1β预处理NP细胞24小时后,三种强度（0.1 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2）的LIPUS处理,均能明显上调Acan、Vimentin、Laminin a mRNA的表达,其中强度为0.5W/cm2 LIPUS处理组的效果最佳。3.在IL-1β预处理NP细胞24小时后,强度为0.1W/cm2和1.0W/cm2的LIPUS处理的MMP13 mRNA表达量较对照组有增高趋势,而强度为0.5W/cm2的MMP13 mRNA表达量与对照组相比无明显差异。3.30G针针刺适合小鼠IDD模型的建立3.1采用26G针针刺小鼠尾9/10椎间盘,1周后取材,发现小鼠的AF开始出现明显退变,而NP损伤更为严重,大部分NP脱落,难以实施椎间盘评分。Acan、Col2、Col1、MMP13等抗体的免疫组化染色,发现26G针针刺尾椎间盘后AF中的Acan、Col2、Col1、MMP13的表达在损伤早期均较对照组有增高的趋势。3.2采用30G针针刺小鼠尾9/10椎间盘,2周后取材,发现小鼠的NP、AF均出现明显退变,NP细胞部分丢失,脊索样细胞减少,细胞簇开始形成,基质增加;而AF的同心圆结构出现紊乱,并开始出现圆形软骨样细胞,说明针刺尾椎间盘可造成椎间盘明显退变。4.LIPUS可减轻针刺小鼠尾椎间盘退变的程度4.1在组织形态学上,针刺3周后,针刺组的NP细胞严重丢失,所剩的NP细胞均形成细胞簇群;而针刺侧的AF同心圆结构消失,反折入NP内,并累及到对侧AF;而超声组的NP及AF均出现了不同程度的退变,但仅有少部分NP出现了脊索样细胞减少及细胞簇群形成,而健侧的AF未出现明显退变,提示超声处理可延缓椎间盘退变的进程。4.2从椎间盘评分结果来看,超声组的NP及椎间盘总体评分明显低于针刺组;而超声处理组的AF评分低于针刺组。表明采用0.5W/cm2、频率为3MHz、占空比为50%治疗参数的LIPUS治疗2周能明显改善针刺损伤所致小鼠椎间盘的退变程度,且NP的退变程度改善更明显。4.3在椎间盘损伤早期Acan、Col2的表达增加,但随着退变加剧又出现降低。而LIPUS缓解椎间盘退变可能与下调MMP13,上调Acan、Col1、Col2等表达有关。结论1.LIPUS能够促进NP细胞增殖、迁移及增加细胞外基质、胶原及细胞骨架等相关基因的表达。2.中强度和高强度（0.5W/cm2和1.0W/cm2）的LIPUS对NP细胞增殖、迁移及增加Acan、Col2、Vimentin、Laminin a等相关基因表达的作用更优于低强度（0.1W/cm2）的LIPUS。3.高强度LIPUS可能有使IL-1β处理所致MMP-13表达量进一步增加的趋势,而中强度的LIPUS此作用不明显。在炎性反应早期,高强度的LIPUS可能促进炎性反应加重。4.强度为0.5W/cm2、频率为3MHz、占空比为50%治疗参数的LIPUS,在上调正常及炎症刺激下NP细胞的Acan、Vimentin、Laminin a等的表达量,促进NP细胞增殖、迁移,及防治IDD效果方面最佳。5.26G大针对小鼠尾椎间盘损伤较严重,不合适用于超声波治疗IDD的建模,而30G小针针刺可引起IDD,针刺2周后已出现明显退变。6.强度为0.5W/cm2、频率为3MHz、占空比为50%治疗参数的LIPUS能够减轻针刺所致尾椎间盘的退变程度。7.LIPUS缓解针刺所致IDD退变,可能与下调MMP13,上调Acan、Col1、Col2表达有关,为超声治疗IDD提供了初步理论依据。