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背景:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者最常见的并发症之一糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN),尤其是2型DN,是导致慢性肾功能衰竭的主要原因之一。肾小球内细胞肥大和细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)增多引起的肾小球肥大是早期DN的特征性病变。目前研究较多且已公认的观点是DN时肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)激活,RAS中的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)参与了DN的发生、发展。DN进展过程中AngⅡ可引起肾小球细胞肥大,还可以诱导多种ECM蛋白的表达增多从而使肾脏ECM积聚,最终导致肾小球硬化。研究表明,花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)代谢途径中脂氧化酶(Lipoxygenase,LO)途径与DN相关,其中白细胞型12-脂氧化酶(12-lipoxygenase,12-LO)m RNA和蛋白水平不仅在高糖刺激的肾小球细胞(系膜细胞和足细胞)和糖尿病模型(1型和2型)肾小球内的表达增多,而且其作用与AngⅡ相似,从而认为它是与DN进展密切相关的新的关键因素。近期研究证实DN时肾小球内12-LO与RAS之间的相互协同作用加速了DN的进展。目前研究已证实DN时12-LO及其产物12(S)-HETE主要通过p38 MAPK信号通路引起肾脏ECM积聚,12-LO和AngⅡ之间的相互影响和相互作用是加速ECM积聚的重要原因之一。12-LO能否像AngⅡ一样引起肾小球细胞肥大,目前尚无可靠而详尽的报道。研究证明DN时肾小球细胞肥大主要是由细胞周期负调控蛋白—细胞周期素依赖性激酶抑制剂(Cyclin-dependent kinase inhibitors,CKIs)的表达异常引起。因此,要明确DN时12-LO能否以及如何引起肾小球细胞肥大,首先要探讨12-LO对CKIs表达的影响。CKIs中作用最为广泛的CIP/KIP家族主要包括p21WAF1/CIP1(p21),p27KIP1(p27),p57KIP1(p57),它们均可与多种周期素依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)结合而抑制后者的活性,其表达异常可引起细胞周期停滞,导致细胞肥大。目前研究显示在DM条件下,肾小球肥大,肾小球内相关的p21、p27表达增加,p57表达无明显变化,p57可能不参与DM肾小球肥大的病理机制。由此可见,探讨p21和p27在DN发展过程中的变化及它们对治疗药物的反应对寻找新的治疗靶点和对策也具有非常重要的意义。因此,我们设想DN时12-LO-12(S)-HETE、RAS及其交互作用通过影响CIP/KIP家族CKIs途径引起肾小球细胞肥大。方法:(1)通过手术在SD大鼠皮下植入微型渗透泵,观察AngⅡ(400 ng·Kg-1·min-1速度持续泵入14天)直接刺激后肾小球内12(S)-HETE水平及p21、p27、p57蛋白表达变化,对照组泵注乙醇胺。(2)通过手术在SD大鼠皮下植入微型渗透泵,观察12(S)-HETE(1 mg·Kg-1·d-1速度持续泵入7天)直接刺激后肾小球内AngⅡ水平及p21、p27、p57蛋白表达,对照组大鼠泵注乙醇胺。改良系列过筛法分离出大小不同的肾小球,Western blot检测大、小肾小球内AT1蛋白表达。(3)采用高糖(30mmol/L)刺激体外培养的肾小球系膜细胞,正常对照组培养液葡萄糖浓度为5.6mmol/L,24h、48h后检测系膜细胞内p21、p27、p57蛋白表达。检测自发性2型DM模型肥胖db/db小鼠肾小球内p21、p27、p57蛋白表达,对照组为瘦db/m小鼠。(4)对照组大鼠标准饲料喂养。高脂饮食基础上腹腔注射小剂量链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)建立2型DM大鼠模型,认定血糖>16.7mmol/L为模型成功,将成模的DM大鼠随机分为2组:糖尿病肾病组(DN组)和洛沙坦治疗组(ARB组,洛沙坦灌胃,5 mg·Kg-1·d-1)。6周后测量24h尿白蛋白、血糖,处死大鼠,测量并记录体重、右肾重量,留取部分肾组织病理制片,过碘酸-希夫氏(Periodic acid schiff,PAS)染色观察肾脏病理结构;部分肾组织用过筛法分离肾小球并检测肾小球内12(S)-HETE含量及p21、p27、p57蛋白表达。(5)对照组大鼠标准饲料喂养。高脂饮食基础上腹腔注射小剂量STZ建立2型DM大鼠模型,造模成功的DM大鼠随机分为2组:糖尿病肾病组(DN组)和12-LO抑制剂CDC治疗组(CDC组,CDC后腿皮下注射,8 mg·Kg-1·d-1,3次/周)。8周后测量24h尿白蛋白、血糖,处死大鼠,测量并记录体重、右肾重量,留取部分肾组织病理制片,PAS染色观察肾脏病理结构;部分肾组织用过筛法分离肾小球并检测肾小球内AngⅡ含量,p21、p27、p57蛋白表达。采用改良系列过筛法分离不同大小的肾小球,检测各组不同大小肾小球内AT1蛋白表达。用竞争性RT-PCR方法检测DN组肾小球内AT1 m RNA表达。Western Blot检测DN组不同大小肾小球内p21、p27、p57蛋白表达及ELISA检测DN组不同大小肾小球内AngⅡ、12(S)-HETE含量。(6)通过皮下植入微型渗透泵给12-LO基因敲除小鼠(LOKO小鼠)和野生型小鼠(WT小鼠)持续恒速注入AngⅡ(1.1mg·Kg-1·d-1),对照组泵注乙醇胺,7天后处死动物,取肾脏,检测各组肾小球内p21、p27蛋白表达。(7)用过筛法从大鼠肾皮质中分离肾小球,分为对照组和12(S)–HETE处理组,12(S)–HETE处理组在培养液中加入12(S)–HETE(10-6mol/L),6小时后检测肾小球内AT1蛋白表达。(8)12(S)–HETE(10-6mol/L)刺激体外培养的肾小球系膜细胞,并观察加入转录抑制剂Actinomycin D后系膜细胞内AT1 m RNA表达的变化。结果:(1)用微型渗透泵给大鼠皮下注射12(S)-HETE后肾小球内AngⅡ含量明显升高(P<0.01),肾小球内p21、p27蛋白表达增加(P<0.01),p57无明显变化。与对照组相比,泵注12(S)-HETE后肾小球内AT1表达明显升高。与小肾小球相比,12(S)-HETE刺激后大肾小球内AT1表达明显升高(P<0.01)。(2)用微型渗透泵给大鼠皮下注射AngⅡ后肾小球内12(S)-HETE含量明显升高(P<0.01),肾小球内p27蛋白表达增加(P<0.01),p21、p57无明显变化。(3)与对照组相比,高糖刺激24h和48h后系膜细胞内p21、p27的蛋白表达明显增加,p57无明显变化。与db/m组相比,db/db小鼠肾小球内p21、p27表达明显增高(P<0.01),p57无明显变化。(4)与对照组相比,高脂饮食加STZ诱导的DN组大鼠血糖、肾重/体重及24 h尿白蛋白、肾小球内12(S)-HETE含量以及p21、p27蛋白表达明显增加,p57无明显变化。ARB组洛沙坦治疗不影响DM大鼠的血糖、肾小球内p21、p57蛋白表达,但减少了DM大鼠肾重/体重比及尿白蛋白量,且肾小球内12(S)-HETE及p27蛋白表达也明显减少。肾脏病理检查显示对照组大鼠肾小球结构基本正常,DN组大鼠肾小球的毛细血管襻明显肥大,系膜基质增多。洛沙坦治疗6周后,DM大鼠肾小球体积有所缩小,系膜基质有所减少。(5)与对照组相比,高脂饮食加STZ诱导的糖尿病大鼠(DN组)血糖、肾重/体重及24h尿白蛋白、肾小球内AngⅡ含量明显增加,肾小球内p21、p27蛋白表达明显增加,p57无明显变化。与DN组相比,应用CDC抑制12-LO后大鼠血糖、p57无明显变化,肾重/体重、24h尿白蛋白量减少,肾小球内AngⅡ及p21、p27蛋白表达减少。肾脏病理检查显示DN组大鼠肾小球的毛细血管襻明显肥大,系膜基质增多。CDC治疗8周后,糖尿病大鼠肾小球体积有所缩小,系膜基质有所减少。与对照组相比,DN组肾小球内AT1蛋白表达明显增多,与DN组小肾小球相比,DN组大肾小球内AT1蛋白表达明显增多,CDC治疗后肾小球内AT1蛋白表达明显下降。定量竞争性RT-PCR结果显示,与DN组小肾小球相比,DN组大肾小球内AT1 m RNA表达增多(P<0.01)。与DN组小肾小球相比,DN组大肾小球内p21、p27蛋白表达明显增加,并且AngⅡ、12(S)-HETE含量明显增高。(6)与野生型小鼠相比,LOKO小鼠肾小球内p21、p27蛋白表达减少,野生型小鼠泵注AngⅡ后p27蛋白表达明显增加,p21无明显变化,LOKO小鼠泵注AngⅡ后未出现p27蛋白表达增加的改变。(7)与对照组相比,12(S)-HETE刺激后,离体肾小球系膜细胞内AT1 m RNA表达明显增多。加入转录抑制剂Actinomycin D后12(S)-HETE诱导AT1 m RNA表达的作用被阻止。结论:(1)糖尿病肾病肾小球肥大与细胞周期素依赖性激酶抑制剂CIP/KIP家族中p21、p27有关,与p57无关,且p21、p27与肾小球肥大程度有密切关系。(2)12(S)-HETE和AngⅡ之间有相互协同作用,12(S)-HETE增强AngⅡ受体AT1的表达从而增强AngⅡ的效应。(3)12(S)-HETE和AngⅡ的水平与肾小球肥大程度有密切关系。AngⅡ对p27有影响,但对p21无影响。12(S)-HETE对p21、p27均有影响。12-LO-12(S)-HETE途径、Ang II–AT1途径及其相互作用与肾小球肥大指标p21、p27有密切关系。(4)抑制12-LO和RAS途径可以阻止肾小球肥大,延缓DN进展。