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昆虫体内酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)是一种重要的天然免疫蛋白,参与昆虫的体液免疫和细胞免疫过程。本研究采用原核表达体系,大量表达可溶且具有活性的重组PPO蛋白,可用于各种酚氧化酶(PO)抑制剂的筛选,从而为创制抑制昆虫免疫系统的新型杀虫剂提供条件。利用从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 5龄幼虫体内克隆获得的PPO基因,构建pET-28b-PPO原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中重组表达了亚洲玉米螟PPO蛋白；采用Ni-NAT亲和层析柱快速纯化目的蛋白,进行了 Western杂交鉴定；测定分析了重组PPO蛋白激活为PO后的酶学性质以及不同金属离子(Mg2+,Cu2+和Fe2+)对PPO二级结构的影响。研究结果如下：(1)为了PPO全长表达载体的构建。根据玉米螟幼虫PPO的cDNA全长序列,设计一对特异性表达引物,以cDNA为模板,进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测,在预计大小2686 bp取得了目标条带,克隆测序验证了基因序列的准确性和完整性,表明取得了Of-PPO片段。将取得的Of-PPO片段进行割胶回收,然后与pMD18-T载体连接,连接产物转化TOP10菌株,涂板后挑取阳性克隆菌液,并进行菌落PCR鉴定,成功获得了pMD 18-T-PPO克隆载体。对鉴定后扩增的Of-PPO克隆载体的菌液进行质粒DNA的提取,将pET-28b空载体和pMD18-T-PPO分别用Nde I和Xho I进行双酶切,分别切取目标片段大小,将酶切产物进行回收连接,连接产物转化E.coli RIL BL21(DE3)感受态细胞,进行挑斑鉴定：挑取3-5个菌株,进行菌落PCR验证,最终获得了目标大小片段的条带,完成了pET-28b-PPO表达载体的构建。预测的重组蛋白分子量为75 kDa。(2)pET-28b-PPO的重组表达。在16℃条件下,将含有重组质粒的大肠杆菌表达菌株E.coli BL21分别经过0.4mmol/L、0.2 mmol/L.0.1 mmol/L.0.05 mmol/L.0.025 mmol/L IPTG的梯度诱导过夜。从SDS-PAGE结果来看,重组表达的蛋白分子的大小与预测分子量大小一致,与对照(无IPTG诱导)相比,重组蛋白在75 kDa处有表达,但主要在沉淀中表达,上清中与对照(无IPTG诱导)也有一定的表达量。(3)融合蛋白PPO得到了表达和纯化。重组PPO蛋白激活为PO后最适反应温度为30℃,最适pH为7.2,以L-DOPA为底物时PO催化反应的Vmax为140.8 U/mg.min,Km为2.96 mmol/L.Fe2+存在的情况下重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著增加至53.7%±4.6%,α-螺旋结构成分则显著下降至2.6%±1.2%(P<0.05)；有Mg2+存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降,α-螺旋结构成分稍有上升。有Cu2+存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降为10.0%±1.6%,而α-螺旋结构成分则上升至35.3%±6.9%。结果说明不同金属离子对重组PPO蛋白的二级结构有显著影响。