甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是哺乳动物和其他脊椎动物胚胎时期由肝脏和卵黄囊产生的主要的血清蛋白，在正常成年人的外周血中基本检测不到。甲胎蛋白自被发现以来，作为一个胎儿异常和肿瘤的标志物，在临床诊断和病情监测等方面发挥了重要作用，其在临床中的意义受到人们的充分研究。然而甲胎蛋白的生理学功能及其在肿瘤发生发展中的生物学作用受到的关注却相对较少，只是在最近十年中人们才意识到甲胎蛋白在肿瘤生长中的调节作用并开始实验研究。甲胎蛋白作为原发性肝癌较为敏感而特异性的生化标志，在肝癌普查、早期诊断和疗效判定等方面发挥了重要作用，另外某些胃肠道肿瘤及某些生殖系胚胎肿瘤也高水平表达AFP，如最近常报道的一种高水平表达AFP的胃癌，甲胎蛋白阳性胃癌(alpha-fetoprotein-producinggastriccarcinoma，AFP-GC)是一种特殊类型的胃癌，特征是AFP升高及肿瘤组织表达AFP升高，其临床病理学特征与普通型胃癌有较大不同，更易发生肝转移和早期淋巴道转移，具有明显的侵袭性和恶性生物学行为，发病率约占胃癌的5.1％-15％。由于AFP-GC患者就诊时多有转移，常不能手术根治切除，切除后也易复发，故寻找新的治疗药物和治疗手段乃当务之急。 RNA干扰((RNAinterference，RNAi)是近年来发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术，是一种双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程。目前，在某些病毒性疾病的治疗研究中己取得了一定的进展，在基因功能研究和基因治疗方面也己显示出巨大的应用前景。 miRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类内源性染色体上的非编码单链RNA，长度为21-25nt左右的短序列，在进化上具有高度的保守性，能通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控，在基因调控中扮演着重要的角色。 我们利用miRNA的这一内源生物现象和RNA干涉技术人为的设计出miRRNAi的载体，这个载体上含有一个miR-155结构区域，miR-155是经实验证明的在哺乳动物体(小鼠)体内的一个能生成miRNA的60-70nt内源性前体miRNA(pre-miRNA)。这个载体转入体内后既能够形成一个成熟的miRNA(非编码的单链RAN)又能使其有效的发挥RNAi作用。我们选择了专门为之设计的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTOR载体。在体外构建了能在细胞内表达miRNA的载体，再将载体转染入细胞内，在FU97细胞内转录出miRNA从而引发基因沉默，观察其对FU97细胞AFP基因表达的抑制作用及其对细胞生长增殖抑制作用。 目的： 以可特异性表达甲胎蛋白的人胃癌细胞株FU97为研究目标，利用miRNA的生物学现象和RNA干涉技术，构建能在细胞内表达AFP-miRNA的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTOR载体，通过体外试验探讨AFP特异性miRNA抑制甲胎蛋白阳性胃癌细胞株FU97的AFP基因表达并抑制肿瘤细胞的生长增殖以及其作用机理，为进一步研究AFP基因功能奠定基础，以期为其治疗提供一个新的特异性基因治疗手段，同时为获得AFP基因的最佳miRNA序列和RNAi应用于临床胃癌提供实验基础。 方法： (1)选择3个符合条件的AFP特异性RNA干涉靶序列，分别体外合成两段互补的寡核苷酸，与线性载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTOR连接，转化到OneShotTOP10大肠杆菌中扩增，提取并纯化质粒。 (2)采用DNA琼脂糖凝胶电泳及应用引物EmGFPForwardsequencingprimer和miRNAreversesequentingprimer进行PER鉴定和序列鉴定，以确定合成的寡核苷酸是否已经转入载体质粒中及是否有碱基异常存在。确定载体构建成功后，转染入FU97细胞中。 (3)用脂质体/质粒载体不同剂量及浓度配比转染FU97细胞，荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率，并检测细胞培养上清液AFP含量的变化，筛选出最佳阳离子脂质体/质粒载体配比。 (4)在质粒转染入肿瘤细胞48小时后，用RT-PCR法检测AFP基因在mRNA水平的变化，免疫细胞化学法、化学发光免疫分析仪、流式细胞仪、westernblot检测AFP蛋白表达变化。筛选出AFP基因的最佳miRNA序列。 (5)用筛选出的AFP-miRNA转染FU97细胞，MTT实验检测抑制AFP基因后对FU97细胞生长增殖抑制作用。 结果： (1)成功构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTORAFP-1/2/3载体：①琼脂糖凝胶电泳检测发现，提取质粒大小与试剂盒中所提供阳性质控质粒大小相同，pcDNATM6.2-Gw/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTOR分子量大小为5.8kb，大小符合；②取1ul的质粒扩增菌液进行插入目的基因PCR反应，电泳发现目的条带为260bp左右，大小符合两段引物之间的长度；③基因测序结果表明插入片段的序列与合成的AFP寡核苷酸序列完全相符，即成功构建miRNA表达载体。 (2)筛选出最佳的阳离子脂质体/质粒载体转染复合物的配比为10μl:2μg。 (3)RT-PCR结果表明在mRNA水平，所构建的三个质粒都可抑制AFP基因的表达。 (4)蛋白水平AFP基因表达的变化：①化学发光法结果：取FU97培养上清检测细胞分泌的AFP蛋白含量的变化，实验重复五次，取平均值。计算实验组的抑制率，抑制率=(1-实验组平均值/阴性空白对照平均值)×100％。得出实验组miRNA-AFP1作用后抑制率为45.55％，实验组miRNA-AFP3为35.46％。而实验组miRNA-AFP2抑制率最低为19.19％。统计学分析显示实验组三组与阴性空白对照组之间的AFP水平均不同(P＜0.05)。②免疫细胞化学法结果：棕黄色颗粒沉着代表甲胎蛋白表达阳性，转染后48，阴性空白对照组FU97细胞中的AFP表达较多，多数细胞均有棕黄色颗粒沉着；而实验组FU97细胞中仅个别细胞有棕黄色颗粒沉着。③流式细胞仪检测细胞胞浆蛋白表达结果：转染后48小时，实验组AFP的胞浆蛋白表达分别为37.57％，75.07％，65.75％。在6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTOR-AFP1/2/3的作用下，与阴性空白对照相比，AFP的表达均有降低。说明所构建的载体对AFP有沉默作用。④westernblot结果显示所构建的质粒均可抑制AFP蛋白水平的表达。与阴性空白对照相比，实验组miRNA-AFP1和miRNA-AFP3抑制效果较明显，其抑制率分别为49.82％，44.10％，而实验组miRNA-AFP2的抑制效果最差，抑制率为23.96％。 (5)MTT实验表明抑制了AFP基因表达后能够明显抑制FU97的生长。 结论： 在特异表达AFP的人胃癌细胞株FU97中，利用构建的miRNA-RNAi表达载体明显干扰AFP基因的表达，同时发现抑制AFP基因的表达能够直接抑制人胃癌细胞株FU97的细胞生长增殖。这种方法不仅对体外研究AFP基因功能有一定意义，而且为探讨甲胎蛋白在AFP相关肿瘤的基因治疗方面的应用价值奠定了理论基础和进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗提供了依据。