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以分离和表征技术为主的中药质量控制关键技术和中药标准品、对照品生产技术是现代中药质量控制的两个重要组成。目前,肿节风质量控制大部分是以有效成分之一的异秦皮啶为控制指标,这种单一成分控制方法缺乏全面性。肿节风中的异秦皮啶通常采用溶剂提取结合柱色谱分离来提取、纯化,该方法步骤繁琐、周期长、原料消耗大,无法满足中药现代化生产的需要。本论文以肿节风为研究对象,采用微波辅助提取结合高效液相色谱联用技术,提取分析肿节风中异秦皮啶并建立肿节风指纹图谱;采用微波辅助提取结合高速逆流色谱联用技术分离、纯化异秦皮啶,为肿节风有效成分标准品和对照品生产提供参考依据。主要研究内容包括:
1.综述了微波辅助提取、高速逆流色谱的研究进展,介绍了中药肿节风的有效成分及其质量控制技术。
2.建立了肿节风中异秦皮啶的微波辅助提取/高效液相色谱(MAE/HPLC)分析方法。采用四因素四水平的正交试验设计优化了肿节风中异秦皮啶MAE条件为:提取时间20 min,提取温度65℃,固液比1:10,乙醇浓度60%(v/v)。与索氏提取方法相比,MAE快速、简便、节省溶剂。MAE/HPLC分析方法的线性范围为0.500-100μg/mL、检出限为0.220μg/mL、加标回收率为97.6%、RSDs为0.69%。结果表明,方法快速、准确、精密度高。
3.采用MAE/HPLC分析方法测定了不同批次肿节风中异秦皮啶的含量。建立了肿节风MAE/HPLC指纹图谱,图谱中主要成分的相对保留时间及相对峰面积的RSDs分别小于O.3%和8%。采用主成分分析(PCA)、相似性分析以及基于异秦皮啶的定量指纹谱图技术评价了不同批次肿节风的质量。依据肿节风中异秦皮啶的含量及其色谱指纹图谱开展肿节风质量控制的研究。
4.采用微波辅助提取结合高速逆流色谱技术(MAE/HSCCC)分离纯化肿节风中异秦皮啶。根据异秦皮啶化合物的结构、异秦皮啶在溶剂体系的分配系数和分配比、溶剂体系固定相保留率,根据分析型HSCCC和制备型HSCCC实际分离情况,选择正已烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:2:1:2,v/v)为溶剂体系分离肿节风的MAE提取浸膏,得到异秦皮啶的纯度达99%以上、回收率达80%以上。纯度和回收率的相对标准偏差(RSD)分别小于0.30%和6%。研究结果表明,该方法稳定可靠、重现性好。
5.采用MAE/HSCCC方法的溶剂体系,初步研究了MAE-HSCCC在线分离、纯化肿节风中的异秦皮啶的方法,考察了肿节风浸膏样品溶解溶剂和浸膏样品上样量对分离纯化的影响,优化条件为:以正已烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:2:1:2,v/v)下相为溶解溶剂、选择2.00g肿节风(约300 mg肿节风浸膏)为单次分离的上样量,溶剂体系可连续5次进样,完成单次在线提取-浓缩-纯化过程需3 h,分离得到的异秦皮啶纯度达99%以上、平均回收率为80%。研究结果表明,MAE-HSCCC在线分离纯化肿节风中异秦皮啶方法可行,为实验室制备异秦皮啶对照品提供了方法依据。