【摘 要】
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食品中的致病菌是引起食物中毒的主要原因，这些致病菌的存在严重威胁着人类的健康。传统的培养方法和生化鉴定耗时长，操作繁琐且灵敏度不高；常规PCR法通常1次只能检出一种致病菌
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食品中的致病菌是引起食物中毒的主要原因，这些致病菌的存在严重威胁着人类的健康。传统的培养方法和生化鉴定耗时长，操作繁琐且灵敏度不高；常规PCR法通常1次只能检出一种致病菌且假阳性多。因此，有必要建立起快速、高效、特异、灵敏的检测方法。本研究运用基因芯片技术一次同时对肠出血性大肠杆菌0157:H7、肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单细胞增生性李斯特菌、乙型溶血性链球菌及副溶血性弧菌进行多基因快速检测。针对7种致病菌的rfbE、fliC、invA、hilA、ipaH、femA、nuc、hlyA、prfA、tuf、speB、t1h和tdh共13个基因设计引物，并进行扩增、序列测定和序列比对，结果表明所选用检测靶基因保守性好，除tdh同源性为70％外，其余靶基因片段与各属内或种内其它菌株序列同源性达到88％以上，与其它种属细菌的核苷序列无同源关系；适合用作构建检测芯片的靶标。
扩增好靶基因经异丙醇沉淀纯化后将浓度调整至250～300ng/μL，利用Nano-Plotter NP 1.2点样仪进行点制，每个靶基因10个点，点与点的中心距离为740μm，点的直径为500μm；点样环境湿度为65％～75％，温度为25℃，静置过夜。经水合、紫外交联和洗涤后与标记探针进行杂交。以SNIR>1.5，靶基因10个杂交点荧光强度中位值的平均值在150以上以及扫描图像上杂交样点明显，肉眼可见作为判断标准，三者结果一致则判断为阳性。通过杂交结果可以看出构建的检测芯片特异性好，对上述7种细菌能一一检出；稳定性好，可重复使用5次，最佳杂交温度为58℃，检测灵敏度为5 pg/μLDNA模板浓度。
结果表明本研究所构建的食源性致病菌基因芯片检测方法具有快速、特异灵敏和稳定的特点，在食品卫生检测、病原流行病学调查及风险评估等领域有广泛的应用前景。
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