论文部分内容阅读
研究背景骨肉瘤是青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤,易于转移和复发。15%-20%的患者在首次就诊时就发现了远处转移病灶,患者一旦发生转移后其生存时间显著缩短,骨肉瘤一直缺乏有效的靶向治疗药物。G蛋白偶联受体(GPCRs)是人体内最大的细胞表面受体超家族,是目前最成功的药物靶点,在GPCRs中寻找骨肉瘤可能的诊断治疗靶点具有重要意义。KiSS1/GPR54系统是KiSS1基因和GPR54基因编码的一对配体与受体蛋白,在青春期发育和肿瘤的研究上较多,是青春期发育的重要调控基因,发挥了青春期“开、关”的重要功能,同时在多个肿瘤病程中具备抑制肿瘤转移功能,被成为“肿瘤转移抑制基因”。基于骨肉瘤是青春期好发并具有高转移特性的肿瘤,而KiSS1/GPR54作为青春期“开、关”并在多个肿瘤中具有抑制肿瘤转移的功能,这了提示KiSS1/GPR54在骨肉瘤发展中可能具有重要作用。研究目的(1)检测KiSS1及GPR54在骨肉瘤组织中的表达,分析探索其潜在的临床意义;(2)体内外实验探索研究KiSS1基因编码产物KP-10及受体GPR54对骨肉瘤细胞转移、增殖等生物学特性的影响;(3)探讨KiSS1/GPR54抑制骨肉瘤转移和增殖可能的分子机制。研究方法(1)免疫组织化学(IHC)检测骨肉瘤临床标本中KiSS1和GPR54的表达量并分析其与患者年龄、性别之间的关系,Kaplan-Meier法分析KiSS1/GPR54的表达情况与患者生存时间之间的关系;qRT-PCR和Western Blot检测5例骨肉瘤临床标本和对应瘤旁组织中KiSS1和GPR54的表达量,分析KiSS1/GPR54在骨肉瘤组织和瘤旁组织之间的差异表达情况;qRT-PCR和Western Blot检测KiSS1/GPR54在骨肉瘤细胞系和人成骨细胞系hFOB1.19中的表达情况。(2)构建GPR54的shRNA干扰序列,在GPR54表达量相对较高的MNNG/HOS及ZOS细胞株上构建稳定低表达GPR54(shGPR54)的细胞株;构建GPR54过表达质粒,在GPR54表达量相对较低的143B(与MNNG/HOS同一细胞系来源)和ZOSM(与ZOS同一患者来源)细胞株上构建稳定过表达GPR54(GPR54-OE)的细胞株;qRT-PCT和Western Blot检测骨肉瘤细胞GPR54干扰和过表达效率;体外合成KiSS1基因编码产物KP-10。Wound healing和Trans well实验检测KP-10、GPR54低表达和过表达对骨肉瘤细胞迁移能力的影响;MTS实验检测KP-10或低表达GPR54对骨肉瘤细胞活力的影响;克隆形成实验检测KP-10或低表达GPR54对骨肉瘤细胞克隆形成率和增殖能力的影响;裸鼠尾静脉注射shGPR54的MNNG/HOS细胞,IVIS检测干扰GPR54后对骨肉瘤细胞肺转移能力的影响;裸鼠胫骨原位注射带有luciferase标记的143B细胞,治疗组给予KP-10,IVIS检测KP-10对胫骨原位注射骨肉瘤细胞原位生长和远处转移的影响。(3)使用RNA-seq高通量测序法,检测分析143B细胞给予KP-10后基因表达变化情况,使用KEGG pathway分析差异表达基因富集的信号通路;基于RNA-seq测序结果,qRT-PCR验证骨肉瘤细胞在KP-10/GPR54干预时ETV4的表达情况;进一步通过Western Blot检测ETV4上下游ERK磷酸酶活性、MMP2、MMP9、E-cadherin和N-cadherin的表达,剖析KiSS1/GPR54抑制骨肉瘤转移的分子机制。研究结果(1)KiSS1和GPR54的表达量与骨肉瘤患者年龄、性别之间无显著的相关性,Kaplan-Meier法分析发现骨肉瘤组织中KiSS1或GPR54表达量降低的患者生存时间相对更短;WB和qRT-PCR检测结果显示与瘤旁组织相比,KiSS1和GPR54在肿瘤组织中表达更低;WB检测显示与hFOB1.19相比骨肉瘤细胞系中KiSS1和GPR54的含量更低,且转移能力较强的143B及ZOSM细胞中KiSS1和GPR54表达最低。(2)Wound healing和Trans well实验显示给予KP-10或过表达GPR54可以抑制骨肉瘤细胞的迁移,低表达GPR54促进骨肉瘤细胞的迁移;MTS实验和克隆形成实验显示干扰GPR54表达促进了骨肉瘤细胞的细胞活力同时促进细胞的克隆形成,给予KP-10抑制骨肉瘤细胞的增殖活性和克隆形成能力;裸鼠尾静脉注射MNNG/HOS骨肉瘤细胞实验发现,GPR54低表达后促进了骨肉瘤细胞在小鼠肺内的转移;裸鼠胫骨原位注射143B细胞实验发现,给予KP-10抑制胫骨原位骨肉瘤细胞肺转移。(3)RNA-seq高通量测序分析发现,143B细胞给予KP-10后,440个基因表达上调,420个基因表达下调。KEGG pathway分析提示,给予KP-10后差异表达基因主要在16条信号通路中呈现富集状态;重点关注差异表达基因富集程度最大的Transcriptional misregulation in cancer信号通路,选择功能与变化趋势最相符的ETV4基因进行进一步探索,qRT-PCR验证发现骨肉瘤细胞给予KP-10或过表达GPR54后ETV4表达量下调,干扰GPR54后ETV4表达上调;WB检测发现骨肉瘤细胞给予KP-10或过表达GPR54后ETV4上游ERK磷酸化水平,ETV4下游MMP-2、MMP-9及N-cadherin表达量均下调,而E-cadherin表达上调,干扰GPR54后P-ERK、MMP-2、MMP-9及N-cadherin表达量均上调,而E-cadherin表达下调。研究结论KiSS1和GPR54在骨肉瘤组织中表达下调;KiSS1和GPR54在骨肉瘤组织中表达量与患者生存预后时间密切相关;KiSS1基因编码产物KP-10和GPR54参与调控骨肉瘤的迁移和增殖;KiSS1/GPR54可能是通过调节ERK磷酸化,进而调节ETV4-MMP&EMT信号发挥抑制骨肉瘤细胞生物学作用的。