目的：　　脓毒症(Sepsis)是指各种微生物(如病毒、细菌、真菌、支原体等)感染机体后引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），通过不同的免疫途径，大量的炎症介质被激活并释放入血，令机体遭受自身免疫性损伤。脓毒症的病因多种多样，按严重程度可分为脓毒症（sepsis）、严重脓毒症（severe sepsis）和脓毒性休克(septic shock)。若得不得有效的调控，再进一步发展可导致多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome MODS)和多器官功能衰竭（Multiple Organ Dysfunction Failure，MOF），甚至致死。由于脓毒症的发病机制涉及到机体的多个方面反应，如细菌内毒素、全身炎症网络效应、免疫功能障碍、肠道细菌/内毒素的移位、凝血功能紊乱和基因多态性等，故其发病机制十分复杂，但本质上是机体的自身免疫性损伤反应。近年来，越来越多的脓毒症研究报道围绕着线粒体展开。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞提供能量外，线粒体还参与诸如细胞信息传递、细胞分化和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。脓毒症时，机体的免疫性损伤反应可导致细胞内线粒体的损伤，从而引起一系列的连锁反应，在临床上表现为不同程度的器官功能障碍。所以目前的脓毒症研究重点放在线粒体功能的保护上。中药在抗脓毒症研究方面已有三十多年的历史，总结了脓毒症治疗的“三证三法”，即毒热证和清热解毒法；瘀血证和活血化瘀法；急性虚证和扶正固本法，一定程度上使病死率降低，显示了中药在防治脓毒症中的优势地位。本课题主要研究四逆汤对脓毒症大鼠心肌线粒体损伤的保护。以失血和内毒素“二次打击”建立脓毒症大鼠模型，并使用四逆汤进行早期干预，拟从形态学、酶学和线粒体膜电位等指标来反映四逆汤干预对脓毒症大鼠心肌线粒体的保护作用，探讨四逆汤是否存在整体调控作用，辅助救治小儿脓毒症，以达到降病死率、提高生存质量的目的。　　方法：　　1.建立动物模型及分组　　SD大鼠70只，雌雄各半，每只体重200-300g，由广东省医学实验动物中心提供，随机分成7组，每组10只，其中正常对照组10只，模型1d、3d、5d组各10只，四逆汤治疗1d、3d、5d组各10只，分笼饲养。①脓毒症模型组：实验前禁食12h，3％戊巴比妥钠1ml/kg腹腔麻醉，术区剃毛，乙醇常规消毒，实验大鼠颈动脉穿刺放血2mL（约全血1/6量），12h后经大鼠尾静脉注入LPS7mg/kg。并予蒸馏水3.5ml/kg灌胃，每日1次。将动物放回笼内自由饮食。剔除死亡的大鼠，并重新补充相应的动物模型。②空白对照组：每只实验大鼠仅行颈动脉穿刺不放血，12h后经尾静脉注入7ml/kg生理盐水，并予蒸馏水3.5ml/kg灌胃，每日1次，在第3天取材。前期试验已证明，对照组大鼠经上述处理后，在不同时间点对血液取样行各项检测，数值差异无统计学意义。③四逆汤治疗组：大鼠在经历两次打后，予熬制好的四逆汤（浓度为生药1g/1ml），按3.5ml/kg灌胃，每天1次，一直至相应的取材时间点为止。　　2.指标检测及方法　　(1)大鼠一般情况：　　各组大鼠在相应的取材时点前测量其肛温、心率和呼吸频率。　　(2)脏器的功能指标　　运用全自动生化分析仪检测大鼠血清中的磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）和磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）。　　(3)形态学方面的检测　　①透射电镜下观察线粒体形态学变化，按Flameng分级方法对心肌线粒体进行半定量评分。　　②流式细胞仪检测心肌细胞线粒体的肿胀度。　　(4)线粒体功能检测　　①提取大鼠心肌细胞线粒体后使用流式细胞仪进行线粒体膜电位水平的检测。　　②定磷法检测大鼠心肌线粒体总ATP酶活性。　　③比色法测定大鼠心肌线粒体内源性氧化应激相关因子:SOD、GPx、NO、iNOS。　　3.统计方法　　采用SPSS17．0软件对检测数据进行统计学处理，计量资料以均数士标准差(sx?）表示；多组间采用单因素方差分析；组间均数两两比较，方差齐性者采用LSD法，方差不齐者采用Games-Howell法；P<0．05为差异有统计学意义。　　结果：　　1.动物生命体征的变化　　四逆汤干预组和脓毒症模型组均出现脓毒症相关症状体征，如肛温升高、心率加快、呼吸变促等。　　2.脏器功能指标　　(1)血清CK水平　　与对照组比较，1d模型组和SND干预组CK值均明显升高2倍以上，有显著性差异（P值均<0.01）；3、5d模型组和SND干预组CK值均明显下降，比较无显著性差异。与模型组比较，3dSND治疗组CK值下降更明显，有显著性差异（P<0.01）。　　(2)血清CK-MB水平　　与对照组比较，各模型组和SND干预组CK-MB值均明显升高，其中1、3、5d模型组和1dSND干预组数值有显著性差异（P值均<0.01）。与模型组比较，1、3、5dSND干预组CK-MB值均明显下降，有显著性差异（P<0.01，P<0.01，P<0.05）。　　3．形态学检测　　(1)电镜形态学观察及半定量分析　　与对照组比较，1、3、5d模型组和1d治疗组线粒体电镜半定量评分明显升高(P值均<0.01)。与模型组比较，3、5d治疗组线粒体电镜半定量评分明显下降(P值均<0.01)。　　(2)线粒体肿胀程度　　与对照组比较，1、3、5d模型组心肌线粒体肿胀程度明显升高（P<0.01，P<0.01，P<0.05）。与模型组比较，1、3、5d干预组心肌线粒体肿胀程度明显下降（P<0.01，P<0.05，P<0.01），但与对照组比较，数值仍升高，比较无显著性差异。　　4.线粒体功能检测:　　(1)线粒体膜电位检测　　与对照组比较，1、3、5d模型组心肌线粒体膜电位明显下降，比较有显著性差异（P<0.01，P<0.01，P<0.05）。与模型组比较，1、3d干预组心肌线粒体膜电位明显升高，比较有显著性差异（P<0.01，P<0.01）。　　(2)总ATP酶活性　　与对照组比较，1d模型组总ATP酶活性数值明显下降（P<0.01）；3d模型组数值也有下降，但无显著性差异；5d模型组数值明显升高，比较有显著性差异（P<0.01）。与模型组比较，1、3、5d干预组总ATP酶活性数值均明显升高，有显著性差异（P<0.01，P<0.05，P<0.01）。　　5.线粒体内源性氧化应激相关因子　　(1)与对照组比较，1、3d模型组心肌线粒体SOD活性明显下降，比较有显著性差异（P<0.01，P<0.01）；5d模型组 SOD活性有所回升，比较无统计学意义。与模型组比较，1、3d干预组心肌线粒体SOD活性明显上升，比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。　　(2)与对照组比较，1、3d模型组心肌线粒体GPx活性下降，比较有显著性差异（P<0.05，P<0.05）。与模型组比较，1、3、5d干预组心肌线粒体GPx活性均有提高，比较有显著性差异（P<0.01，P<0.01，P<0.05）。　　(3)与对照组比较，1d模型组心肌线粒体NO含量明显下降（P<0.01），但3、5d模型组NO含量有所下降，无统计学意义（P>0.05）；干预组各时间段NO含量与对照组比较均无统计学意义。与模型组比较，干预组各时间点 NO含量均无统计学意义。　　(4)与对照组比较，1、3d模型组心肌线粒体iNOS活性有所升高，但无统计学意义，5d模型组iNOS活性升高有统计学意义（P<0.01）；干预组各时间点iNOS活性升高与对照组比较均有显著性差异（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。与模型组比较，干预组各时间点iNOS活性均明显升高，有显著性差异（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。6.相关性分析　　(1)大鼠心脏线粒体膜电位与血清CK、CK-MB水平呈具有显著统计学意义的负相关，相关系数分别为－0.472（P<0.01）和－0.428（P<0.01）。　　(2)大鼠心脏线粒体膜电位与SOD、GPx和总ATP酶水平呈具有显著统计学意义的正相关，相关系数分别为0.511（P<0.01）、0.326（P<0.05）和0.486（P<0.01）。　　(3)大鼠心肌线粒体膜电位与线粒体NO含量、iNOS活性均无显著的相关性（r＝0.238，P>0.05；r＝0.111，P>0.05）。　　结论：　　1．脓毒症可引起心功能障碍，心肌酶CK-MB是衡量脓毒症心肌损伤较为特异的临床指标，能间接反映心肌细胞线粒体的功能。　　2．脓毒症时大鼠心肌细胞线粒体抗氧化酶遭到破坏，出现线粒体内呼吸功能下降，细胞能量代谢障碍，表现为SOD、GPx及线粒体膜电位、ATP酶活性下降。　　3．中药方剂四逆汤能有效保护脓毒症心肌细胞线粒体功能，其机制可能与提高线粒体的抗氧化能力，减少氧化损伤，促使之修复，改善线粒体的内呼吸功能有关。