人类肠道病毒71型（Human enterovirus71，简称EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒属，人类肠道病毒A，核酸为单股正链RNA。目前已知EV71的感染可以导致手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、疱疹性咽峡炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病。手足口病在美国和欧洲处于小范围流行的阶段，但是在1975保加利亚和1978年匈牙利有过两次大疫情爆发和高死亡率。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，包括马来西亚、新加坡、台湾、日本、韩国、越南和中国大陆。肠道病毒EV71型有A、B（B1、B2、B3、B4、B5）、C（C1、C2、C3、C4、C5）三个基因型，共11个亚型，病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜，直径约24～30nm，核酸为含有大约7400个核苷酸的单股正链RNA。RNA中仅有一个开放阅读框（ORF），编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5′和3′非编码区（UTRs），与其他肠道RNA病毒一样，在3′末端有多聚腺苷酸（polyA）尾，而其5′末端共价结合有一个小分子量的蛋白（VPg）VP1，P2和VP3三个蛋白暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，因而抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上。近年来，已经开发出不同类型的EV71疫苗，但目前普遍处于临床前开发阶段，包括灭活疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、表位多肽疫苗和病毒样颗粒疫苗。这些疫苗在动物模型中的研究表明中和抗体的产生起关键作用。本研究就目前研究中缺乏批准上市的抗原、抗体（酶标或化学发光）试剂，造成疫苗活性评价中中和抗体效价测定的不准确性和可比性，我们构建了VP1，VP0，VP3三种原核表达质粒，成功的表达了VP1，VP0蛋白，并对其免疫原性做了初步评价而且验证了VP1是抗原决定中心，为EV71诊断试剂盒和亚单位疫苗的研究奠定基础。（一） EV71相关基因片段的体外合成根据GenBank中录入的EV71/Fuyang.Anhui.CHN/19.08/6株全基因序列，翻译成经大肠杆菌密码子优化后的VP1，VP0,VP3的基因核苷酸序列，利用OE-PCR原理设计全基因体外合成的特异性引物并进行体外合成。合成的全长片段TA克隆至pMD18T载体上，经过序列测定和最后的修正合成，成功合成三个外壳蛋白的基因片段。（二）VP1，VP0，VP3的原核表达和VP1的免疫原性分析。分别以三个测序正确的含有基因片段的质粒为模板，用含酶切位点的引物PCR扩增出DNA产物后克隆到原核表达载体pET-32a，分别构建的三种原核表达质粒pET-32a-VP1，pET-32a-VP0，pET-32a-VP3将三种原核表达质粒转入E.coliBL21(DE3)，经过IPTG诱导表达和纯化，进行动物免疫EV71-VP1蛋白的动物免疫，对其免疫原性进行分析。成功构建了三个原核表达质粒对进行原核表达并用Ni-NTA亲和层析法纯化目的融合蛋白。其中VP1，VP0表达量较高，VP3表达量不高。VP1免疫新西兰大白兔和BABL/C小鼠并制备抗血清。ELISA检测pET-32a-VP1和手足口病患儿的血清呈特异性结合反应，其IgG抗体滴度达1：64000，pET-32a-VP0和手足口病抗体滴度:1：32000，pET32a蛋白与仅有患儿的血清较弱结合。说明我们利用原核密码子体外基因合成表达表达纯化的蛋白很好的保留了很好的抗原性，同时也反映了VP1是抗原决定中心。为今后EV71诊断试剂盒和亚单位疫苗的研究提供参考。（三）基孔肯雅病毒衣壳蛋白C和包膜蛋白E2的全基因合成和原核表达分析利用重叠延伸PCR方法体外合成基孔肯雅病毒外壳蛋白C和包膜蛋白E2的全基因序列，并且构建外壳蛋白C和包膜蛋白E2的原核表达质粒。同时根据Expasy软件对E2跨膜疏水的预测，构建缺失疏水区的E2(1-350)突变体原核表达质粒。将测序正确的原核质粒转化至BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测重组质粒的表达情况。经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示缺失突变体pET21b-E2(1-350)融合蛋白表达量较pET21b-E2(1-404)有明显提高。提示E2蛋白跨膜疏水区（351-378aa）对该蛋白的原核表达具有重要影响。