研究背景结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,早期筛查、诊断可以提高癌症患者的五年生存率。但是由于结直肠癌病变早期的病灶多位于黏膜层及粘膜下层,因此缺乏典型的早期临床表现。传统的筛查方法包括结直肠镜、大便隐血实验,但结肠镜检为有创检查,而大便隐血筛查实验特异性较差,采用血清学肿瘤标志物对疑似患者及高危人群进行筛查已成为临床最理想的早期无创筛查方法。现有的肿瘤标志物（CA199、CEA、CA242等）虽然在肿瘤早期有一定升高,但单一肿瘤标志物的敏感性、特异性均不高,将多种肿瘤标志物与现有临床检验指标联合检测分析可在一定程度上弥补单一肿瘤标志物的不足,但仍需一种更加便捷、精确、高效的方法来提高肿瘤的诊断效能。肿瘤诊疗已进入精准医学时代。在精准医学的大背景下,液体活检作为一种便捷、微创、能够动态反映肿瘤基因谱的方法,在临床研究与实践中发挥着越来越重要的作用。与蛋白质类肿瘤标志物相比,核酸类肿瘤标志物能更早地从分子层面反应机体的病理生理变化。此外,核酸类肿瘤标志物可以与靶m RNA特异性碱基互补配对,以带有专一性的方式调节基因表达,因而可作为靶向治疗工具。因此,以核酸类肿瘤标志物为靶点构建诊疗一体化技术已成为结直肠癌精准诊疗最具价值的手段之一。但是现有的核酸类肿瘤标志物检测技术如扩增受阻突变系统（Amplification refractory mutation system,ARMS）、数字PCR（Digital PCR,d PCR）、下一代测序技术（Next-generation sequencing,NGS）、逆转录聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）等通常需要专业的人员操作、复杂的引物设计以及多次温度循环,均限制了核酸类肿瘤标志物在临床上的进一步应用。综上,本研究针对不同的结直肠癌相关的核酸类肿瘤标志物靶标包括循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ct DNA）和micro RNA（mi RNA）分别建立了全新的生物传感平台,并对其临床效能进行了评价,为液体活检在结直肠癌早期诊断中的应用提供了新的方法和思路。此外,通过对结直肠癌患者与非结直肠癌患者的凝血功能指标、肿瘤标志物与临床分期的关系进行了探讨,可为结直肠癌的早期诊断提供一定的参考价值。研究目的1.探讨结直肠癌患者凝血功能指标和肿瘤标志物与临床病理特征的关系;2.建立基于ID环3D编码微球的ct DNA多重检测平台并对其用于检测结直肠癌临床样本的性能进行评价;3.建立基于双链特异性核酸酶触发滚环扩增的mi RNA-21太赫兹超材料传感平台。研究方法1.通过对200例结直肠癌患者、100例结直肠良性病变患者和100例健康者的凝血功能指标和肿瘤标志物进行统计分析。2.设计了一种DNA互锁结构单元—ID环（Interlocked DNA ring,ID ring）鉴定单元,其包含两个互锁的DNA单链环,分别为识别环（用于ct DNA识别）和报告环（用于信号报告）。识别环拥有与靶标ct DNA互补的序列,当识别环和ct DNA识别互补成DNA双链之后,特定的限制性核酸内切酶（Restrictive endonuclease,RE）可识别ct DNA中的突变位点（单碱基突变）并对其进行切割,从而打开识别环并能释放报告环,报告环释放出来之后能作为模板触发滚环扩增（Rolling circle amplification,RCA）并进行信号输出,因此可以实现ct DNA的特异、灵敏检测。通过聚丙烯酰氨凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）、原子力显微镜等对ID环鉴定单元进行表征及优化,采用血红素-G-四联体DNA酶显色实验及荧光信号检测进行结果输出。3.在悬浮微阵列中设计了三维（Three-dimension,3D）编码微球单元。在3D编码微球单元中,使用两种不同的荧光染料编码微球,通过调节两种荧光染料的比例组合可用作针对不同靶标ct DNA的二维（Two-dimension,2D）编码微球（X,Y）。然后,将当靶标ct DNA存在时发生RCA扩增,所得扩增产物结合的荧光蛋白信号（即荧光强度）用作Z坐标。由此建立以（X,Y）作为确定靶标种类的2D编码微球,Z信号作为确定ct DNA量的（X,Y）3D编码微球单元。4.将上述ID环鉴定单元和3D编码微球单元有机整合,建立了一种基于ID环3D编码微球的ct DNA多重检测平台。选取结直肠癌相关的KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF四种突变类型的ct DNA作为靶标,并构建四种2D编码微球分别为X1Y1、X1Y2、X2Y1、X2Y2作为四种靶标ct DNA的编码,采用藻红蛋白与所得RCA产物相结合,藻红蛋白的信号强度代表第三维信号Z,从而建立起不同靶标ct DNA的3D编码。以阴性对照样本与四种ct DNA的混合样本作为对照验证平台的特异性,以合成的不同含量的ct DNA作为质控品验证平台的灵敏度。收集临床样本（血液、粪便、尿液）,并采用该平台和传统测序方法去检测临床样本中的四种靶标ct DNA,通过卡方检验等统计方法对两种检测方法的一致性进行比较。5.以结直肠癌相关的核酸类肿瘤标志物mi RNA-21作为靶标设计DNA捕获探针,并将其偶联在磁珠上,当靶标mi RNA-21存在时能被探针捕获形成DNA-RNA复合物,双链特异性核酸酶（Duplex-specific nuclease,DSN）能识别该复合物,降解其中的DNA部分并暴露DNA探针上的RCA引物部分。引物被暴露后可通过磁珠表面的RCA实现核酸原位扩增,通过使用太赫兹超材料技术测量扩增前后磁珠的太赫兹频率移动差值以获取核酸扩增产物信号值以此建立基于太赫兹超材料技术的mi RNA-21传感平台实现靶标的高特异、高灵敏检测。研究结果1.纤维蛋白原（Fibrinogen,Fib）的高水平可能与原发肿瘤的深度浸润和发生区域淋巴结转移有关;肿瘤标志物可能会在结直肠癌发生区域淋巴结转移和远处转移的情况下水平进一步升高;早期（Ⅰ期）癌症患者的Fib、D-二聚体（D-Dimer,D-Di）和CA242较良性病变患者明显升高。2.ID环鉴定单元显色实验对靶标KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF的检测限分别可达0.4%、0.3%、0.4%、0.5%。而后通过荧光实验对KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF的检测限分别可进一步提升至0.3%、0.1%、0.2%、0.4%。3.基于ID环3D编码微球的ct DNA多重检测平台的成功建立分为两方面进行验证。特异性方面,该平台可以实现阴性对照样本、四个阳性对照样本（仅含一种靶标ct DNA）以及混合样本（含有四种靶标ct DNA）的区分;灵敏度方面,该平台对KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF的检测限分别可达0.05%、0.1%、0.1%、0.05%。将我们的多重检测平台和传统测序分别对结直肠癌患者的187份血液标本、20份粪便标本和20份尿液标本进行检测及统计分析,结果表明两种方法的检测结果具有较好的一致性（P>0.05）。4.成功验证了DSN触发RCA体系的可行性,随后与太赫兹超材料技术联合成功构建了生物传感平台。条件优化后,该传感器的线性范围为10 f M至10 n M,检测限为8.49 f M,具有识别其他干扰mi RNAs的能力和良好的重复性。研究结论1.通过对结直肠癌患者的肿瘤标志物与凝血功能指标统计分析后发现二者存在一定的正相关关系,虽然目前还不能形成诊断标准,但是可以作为除临床表现与病理活检以外的早期筛查和预后判断的有力补充与佐证。2.成功建立了基于ID环3D编码微球的ct DNA多重检测平台,该平台在临床样本检测性能方面与测序方法有着较好的一致性,但是我们的平台所花费的时间更短、成本更低并且具有更高的检测灵敏度（可达0.05%）。3.基于太赫兹超材料技术,成功建立了联合DSN触发RCA过程的生物传感器,实现了靶标mi RNA的高灵敏、特异检测。