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喉癌是一种较常见的恶性肿瘤，严重危害人类的健康。在我国，喉癌约占全身肿瘤的2％，占头颈部肿瘤的11—12％。目前临床上常用的治疗方法（手术、放疗和化疗）都存在一定的局限性，因此需要探索一种有效治疗喉癌的的新方法。军事医学科学院二所三室构建的携带人野生型p53基因和肿瘤免疫相关基因B7—1、GM—CSF的重组腺病毒（命名为BB—102）感染喉癌原代细胞后，能明显抑制癌细胞的增殖并诱导其凋亡，而且体外能诱导自体外周血淋巴细胞生成肿瘤杀伤性CTL细胞。本研究在此基础上，研究BB—102对种植喉癌细胞系的裸鼠的治疗效果，为进一步走向临床提供新的治疗方案。同时，我们还探讨了p14ARF对喉癌细胞的抑制作用及对内源性p53的影响，以便加强自体p53水平，从而为进一步防治喉癌提供实验依据。据此，本研究完成以下工作： 1．腺病毒的扩增与质量检定 在293细胞中分别扩增BB—102和携带绿色荧光蛋白基因的对照重组病毒Ad-GFP；以氯化铯密度梯度超速离心法纯化病毒；以蚀斑分析法测定病毒滴度；按照《中国生物制品规则》之通则，检测重组腺病毒BB—102的质量。结果表明：Ad-GFP和BB—102的滴度分别为1.1×1011、2.4×1010；重组腺病毒BB—102的质量符合《中国生物制品规则》的要求；重组腺病毒介导的目的基因可以在喉癌细胞中有效表达。 2．重组腺病毒介导人野生型p53、B7—1和GM—CSF基因对喉癌的临床前研究 建立喉癌裸鼠模型，瘤内注射BB—102、Ad-GFP和PBS，在裸鼠体内进行人喉癌的基因治疗的临床前研究，对肿瘤组织进行测量、病理学检查、摘 要免疫组化等研究。结果表明：在实验组与对照组之间经多因素析因方差分析，肿瘤重量和瘤体积具有显著性差异。经治疗后，实验组肿瘤中未发现大变个P53的表达，Ki67阳性表达率极低，悦明BB—102在喉癌细胞中有效表达并能显著抑制喉癌细胞在裸鼠体内增殖。同时光镜和透射电镜下可见肿瘤细胞的坏死、i)M亡及炎性细胞浸润。 3．pl4叩’基因抑制喉癌细胞生长及其对内源性p53表达的影响 采用基因转染技术，将全长野生型 PI4“”CDNA转染到人喉鳞状细胞癌HepZ细胞中，利用流式细胞仪、RT—PCR和 WesternEloting等万法研究其对细胞周期、内源性野生型p53表达的影响。结果显示：转染N叩’基因的Hep习细胞的生长受到明显抑制，其克隆形成能力为转染空载体的 5 7 ％。细胞分析表明，转染刊“”CDNA48 ’J＼时后，处在＊G；和 G。／M期的细胞皆增加了一倍。同时，Western Bloting分析结果表明，内源性野生型p53表达明显卜升。 根据以上比较实验，我们得到如下结论： BB－102在喉癌基回治疗中具有较好的应用前景，可望发展成临床卜的一种抗癌剂。同时，pl4“”基因的失活可能是喉癌发生过程中的一个重要因素，野生型p14的恢复，上调喉癌HepZ细胞中内源性野生型p53的表达并抑制喉癌细胞生长，进一步发挥p53肿瘤抑制作用，有可能成为临床基因治疗的又一新靶点。