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丙泊酚作为一种静脉麻醉药,在临床麻醉中应用广泛。有研究表明,其可显著增加细胞毒性T淋巴细胞的活性,具有抗肿瘤免疫作用；还可作为肿瘤H460细胞内质网应激和JNK信号通路的正向调节因子,抑制细胞的增殖、诱导及凋亡,亦可抑制肺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤等多种肿瘤细胞的侵袭和转移,这些都显示丙泊酚具有抗肿瘤作用。在肿瘤的转移过程中,Wnt信号通路扮演着重要的角色。Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络,至少包括三条信号通路：①经典信号通路：Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路,主要在细胞核内激活靶基因；②细胞极性通路：Wnt/PCP通路,主要涉及氨基末端激酶和细胞骨架重构；③Wnt/Ca2+信号通路,主要调节细胞运动和细胞粘着性。它们参与细胞分化、细胞极性形成、细胞迁移和增殖等生物学过程。而经典信号通路还参与肿瘤的发生发展过程。作为Wnt/β-catenin信号通路的重要部分,上皮型钙粘蛋(E-cadherin)与其胞内域相连接的p-连环蛋白(β-catenin)构成的E-钙粘蛋白-连环蛋白复合体(E-cadherin/catenin)是细胞间粘附分子的重要部分,在抑制肿瘤的侵袭转移过程中发挥着极其重要的作用。E-cadherin是介导细胞之间粘附连接的主要蛋白分子,发挥着维持细胞极性和组织结构完整性的功能,它的抑癌作用主要是通过与β-catenin形成复合体介导同质细胞之间的相互粘附,抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭性,同时上皮型钙粘蛋(E-cadherin)竞争性和β-连环蛋白(β-catenin)结合,降低细胞内游离型p-连环蛋白(p-catenin)水平,从而抑制其参与Wnt信号通路细胞增殖基因的表达。E-钙粘蛋白复合体中无论钙粘蛋白本身或其组分的异常变化都可能引起细胞之间的粘附能力减弱以及肿瘤细胞的运动能力增强,从而导致细胞容易脱离、侵袭和转移。在没有Wnt信号刺激的情况下,β-catenin与GSK-3组成的降解复合物结合,通过磷酸化,泛蛋白化等过程发生降解,使胞质β-catenin保持在较低水平。有研究发现,p-连环蛋白(β-catenin)的表达与肿瘤的转移密切相关,并且β-catenin的表达与肿瘤组织的低分化以及淋巴结转移以及人类多种肿瘤转移都有密切的关系,例如乳腺癌,胃癌,前列腺癌。我们前期研究发现,丙泊酚可抑制MADB106肿瘤细胞的肺转移,并下调转移瘤中MTA1和Wntl的表达,表明丙泊酚可能通过Wnt通路抑制肿瘤的转移及增殖。为进一步探讨丙泊酚对肿瘤转移的作用及机制,本研究通过MADB106肿瘤细胞肺转移大鼠模型,观察不同剂量丙泊酚对肿瘤肺转移及转移瘤组织E-cadherin和β-catenin表达的影响。材料和方法1.实验动物、药品和试剂清洁级Fischer344雄性大鼠,12～14周龄,体重200～220g(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)。鼠抗人E-cadherin单克隆抗体(即用型),鼠抗人β-catenin单克隆抗体(即用型)均购自proteintech-武汉三鹰生物技术有限公司；丙泊酚(英国阿斯利康公司,200mg/20ml,批号JK222)。2.肿瘤细胞培养MADB106肿瘤细胞系(武汉大学中国典型培养物保藏中心提供),MADB106是大鼠乳腺腺癌细胞系的一种选择性变异,经静脉注入Fischer344大鼠循环系统后,只高选择性地种植转移在大鼠肺部。MADB106细胞在RPMI1640培养液(1640基础培养基90%,FBS10%,双抗0.1%)中培养,放于37℃,100%湿度和5%C02的培养箱中培养,并通过使用0.25%胰蛋白酶消化后传代培养。3.动物分组和处理40只大鼠随机分为4组：生理盐水组(S组)；脂肪乳剂组(F组)；丙泊酚30mg/kg组(P1组)；丙泊酚50mg/kg组(P2组),每组10只。1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射后行股静脉置管,经大鼠股静脉持续泵入等容量生理盐水,脂肪乳剂和丙泊酚,维持鼠肛温在36-37℃,呼吸频率约为60次/分,心率320-340次/分左右；给药1小时后经大鼠股静脉注入0.5mL MADB106肿瘤细胞(2×105/ml),拔除股静脉置管,缝合切口,在SPF级环境中饲养三周。4.标本采集及肺部转移瘤计数3周后,1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后摘除眼球放血处死。固定于操作台,行颈部正中切开并气管插管固定。快速打开胸腔分离左右肺。将大鼠置于头高脚低位,经气管插管缓慢注入4%多聚甲醛固定液,待整个肺的下3/4完全膨胀后停止注入固定液,取出全肺,用生理盐水冲洗肺表面,将全肺投入4%多聚甲醛固定液中固定24小时。将固定好的肺组织取出,放在滤纸上吸干表面的固定液后,由两名未参与实验人员直接计数肺表面转移瘤数目,并进行统计。5.免疫组化染色标本经石蜡包埋,切成4μm薄片,贴于载玻片上,经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水,蒸馏水洗5min；热修复抗原后自然冷却,PBS洗3次,5min/次；在3%H2O2孵育5-10min消除内源性过氧化酶影响；PBS洗3次,5min/次；滴加正常山羊血清封闭液室温下20-30min,甩去多余液体；滴加一抗4℃过夜；37℃下复温30min；PBS洗3次,5min/次；加生物素化二抗,室温下30min；PBS洗3次,5min/次；DAB显色；蒸馏水冲洗,苏木素复染；脱水、透明、封片。6.指标检测6.1计数肺转移瘤的数量及肺表面结节转移抑制率大鼠饲养3周后处死,切除肺肿瘤组织,置于4%中性福尔马林固定24h,再经70%的酒精脱洗后,计数肺转移瘤的结节数,计算肺表面结节转移抑制率：转移抑制率(%)=(1-用药组平均转移结节数/对照组平均转移结节数)×100%。之后常规石蜡包埋,41μm连续切片作免疫组化标记。6.2结果判定β-catenin与E-cadherin在正常肺组织,定位于细胞膜,免疫组化阳性反应为棕黄色或黄色细颗粒状着色。肺转移瘤组织中则主要表现出不同程度的细胞质和或细胞核显色,而细胞膜的显色减少,免疫组化阳性反应为棕黄色或黄色细颗粒状。光镜10x40倍下,于细支气管或肺泡上皮阳性染色处随机选择5个视野,用Olympus DP70CCD采集图像。采用Image-pro plus 10.0免疫组化彩色图像分析系统对结果进行半定量分析,以图片中一个阳性细胞为基础,测定、分析整幅图片的阳性细胞平均光密度(OD)值。7.统计学处理统计学分析采SPSS 13.0统计软件,计量资料,E-cadherin和β-catenin在各组间的表达以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,相关性分析采用Pearson法,以p<0.05认为具有统计学意义。结果1.肺转移瘤数目及转移抑制率S组与F组相比,肺转移瘤数目无显著差异(p>0.05)；与S组相比,P1组和P2组肺转移瘤数目减少(p<0.01),转移抑制率增加(p<0.01)。P2组和P1组相比,肺转移瘤数目减少(p<0.01),转移抑制率增加(p<0.01)。F组、P1组和P2组肺表面结节转移抑制率分别为9.63%,48.15%,68.89%,P2组明显高于F组。肺转移瘤个数与丙泊酚剂量负相关,Pearson相关系数为-0.879(p<0.01)。2.转移瘤中E-cadhrin,p-catenin的表达E-cadherin的表达,S组和F组肿瘤组织染色深,数量多,平均光密度值的差异无统计学意义,两组E-cadhrin的表达无显著差异(p>0.05)；与生理盐水组(Saline组)相比,P1组和P2组中的肿瘤组织染色浅,数量少,平均光密度值减少,E-cadhrin蛋白表达减少,差异有统计学意义(p<0.05)；P2组和P1组相比,肿瘤组织染色浅,数量少,平均光密度值减少,E-cadherin蛋白表达减少,差异有统计学意义(p<0.05)。E-cadherin的表达与丙泊酚剂量负相关,Pearson相关系数分别为-0.755(p<0.01)。β-catenin的表达,S组和F组肿瘤组织染色深,数量多,平均光密度值的差异无统计学意义,两组β-catenin的表达无显著差异(p>0.05)；与生理盐水组(Saline组)相比,P1组和P2组中的肿瘤组织染色浅,数量少,平均光密度值减少,β-catenin蛋白表达减少,差异有统计学意义(p<0.05),P2组和P1组相比,肿瘤组织染色浅,数量少,平均光密度值减少,β-catenin蛋白表达减少,差异有统计学意义(p<0.05)。β-catenin的表达与丙泊酚剂量负相关,Pearson相关系数分别为-0.693(p<0.01)。结论丙泊酚可通过抑制Wnt/β-catenin通路,下调转移瘤组织中E-cadherin和β-catenin的表达,从而抑制MADB106细胞肺转移,呈剂量依赖性。