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菊芋和菊苣是典型的果聚糖积累植物,它们的块茎和根部均富含着大量的果聚糖,这些果聚糖不仅为植物的生长提供了营养,还在耐盐耐旱方面显示出相当的作用,而其中1-果聚糖外切水解酶(1-FEH)在其水解果聚糖生成果糖的过程中起到了关键性的作用。随着人们生活水平的提高,果糖作为一种健康食品渐渐进入人们的生活,活跃在食品加工、医疗等领域。目前的果糖工业化生产一般是通过蔗糖的水解获得,而利用果聚糖外切水解酶水解菊芋来获得果糖的研究并不多。因此本文首先对菊芋未克隆出来的第三个果聚糖外切水解酶Ht1-FEH Ⅲ进行了克隆和表达,并比较了菊芋和菊苣中六种果聚糖外切水解酶的活力。选择活力最高的菊苣果聚糖外切水解酶Cil-FEH ⅡA进行了固定化,利用其直接酶解菊芋块茎浸提液和果糖结晶的过程。主要研究结果如下:1.对未克隆出来的菊芋Ht1-FEH Ⅲ重新进行了克隆,其核苷酸序列与从已有菊芋数据库中拼接出来的序列进行对比基因序列一致,翻译后的氨基酸序列均包含有FEH家族的三个保守结构域NDPNG、FRDP、WECPD。利用毕赤酵母蛋白表达体系,发现其具有1-FEH的酶活。鉴于菊苣的3个1-FEH序列已知,但酶的基本性质还不太明确,在本研究中对菊苣的Ci1-FEHⅠ、Ci1-FEH ⅡA、Ci1-FEH ⅡB同样进行了毕赤酵母表达和纯化,通过对这四种酶酶学性质分析,发现Ht1-FEHⅢ的最适温度是55℃,最适 pH 为 5.5;Ci1-FEH ⅡA 的最适温度姜 40℃,最适 pH 是 5:Ci1-FEH Ⅰ 和 Ci1-FEHⅡB的最适温度是30℃,最适pH是6。在底物特异性分析中得出,Ht1-FEH Ⅲ与一般的果聚糖水解酶不同,不仅能够水解β(2,1)键和p(2,6)键果聚糖,还对蔗糖具有一定的水解能力。2.将菊芋和菊苣的6种果聚糖外切水解酶(另外2种菊芋1-FEH已经在2014年被本实验室克隆和表达)活力进行了测定,发现Ci1-FEH ⅡA的活力最高,因此对该酶进行了吸附交联法的固定化研究。优化的固定化条件分别是吸附温度为30℃、吸附pH为4.5、吸附时间为3h、戊二醛浓度为0.125%、交联温度为10℃和交联时间为2h。固定化后的果聚糖外切水解酶的最适温度得到了提高,从40℃提高到了 50℃。以菊粉和菊芋浸提液为底物,固定化后的Ci1-FEH ⅡA表现出了良好的酶解能力:在酶解菊芋浸提液的过程中,在48h就将高聚合度的果聚糖基本转化为果糖和蔗糖。3.由于液态果糖不利于存储,在本研究中,通过预实验,得到结晶果糖的最佳条件为料液比1:10、降温温差为55℃-4℃,晶种添加量为3%。通过菊芋块茎酶解液的浓缩,再用此条件对酶解液进行了两次结晶,两次结晶后果糖回收率为21.51%。