【摘 要】
：
目的:研究尿石素A（urolithin A,Uro A）抑制肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）增殖及其初步机制,为防治EV71感染提供新的候选药物,为抗病毒药物研发提供参考。方法:以RD细胞为感染模型进行以下实验。1、Uro A对EV71增殖的影响（1）CCK8（cell counting kit 8,CCK8）检测Uro A对细胞的毒性,筛选最大无毒浓度。（2）通过蛋白免疫
【基金项目】
：
遵义医科大学2018年度学术新苗培育及创新探索专项项目（黔科合平台人才[2018]5772-068）； 遵义市科技局-遵义医科大学科学技术联合资金项目（遵市科合HZ字[2019]18号;遵市科合HZ字[2020]61号）；
论文部分内容阅读
目的:研究尿石素A（urolithin A,Uro A）抑制肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）增殖及其初步机制,为防治EV71感染提供新的候选药物,为抗病毒药物研发提供参考。方法:以RD细胞为感染模型进行以下实验。1、Uro A对EV71增殖的影响（1）CCK8（cell counting kit 8,CCK8）检测Uro A对细胞的毒性,筛选最大无毒浓度。（2）通过蛋白免疫印迹法（western blot,WB）检测Uro A三种给药方式（感染前给药,同时给药和感染后给药）分别对EV71-VP1蛋白表达的影响,筛选有效的给药方式。（3）在Uro A有效给药方式下检测其对EV71增殖的影响:倒置显微镜下观察细胞病变效应（cytopathic cffect,CPE）。通过WB、病毒半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)、实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR）分别对EV71-VP1蛋白的表达、病毒滴度、病毒复制水平进行检测;同时采用WB、TCID50试验在SK-N-SH细胞中检测Uro A对EV71增殖的影响。2、Uro A抗EV71效果评价（1）细胞毒性评价:通过CCK8和细胞病变抑制试验计算Uro A的半数毒性浓度(half cytotoxic concentration,CC50)、半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)和选择指数（selectivity index,SI）,了解Uro A对细胞的毒性,同时与广谱抗病毒药物利巴韦林相比较。（2）有效性评价:EV71感染细胞后分别加入Uro A、利巴韦林和药物溶剂,即:Uro A组,利巴韦林组,对照组。（1）WB检测Uro A和利巴韦林对EV71-VP1蛋白表达的影响。（2）剂量依赖实验:WB检测不同浓度Uro A和利巴韦林作用下,EV71-VP1蛋白的表达情况。（3）比较三种尿石素类物质Uro A、Uro B、Uro C对EV71的影响:CCK8试验筛选药物对细胞的最大无毒浓度,通过WB检测EV71-VP1蛋白的表达。3、Uro A抑制EV71增殖的机制探索正常细胞内分别加入药物溶剂、Uro A,EV71感染细胞后分别加入药物溶剂、Uro A,共分为四组,即:空白组,空白加药组,Uro A组,病毒对照组。（1）Uro A对病毒粒子的作用:将Uro A和病毒粒子单独或共孵育1h后感染细胞,WB检测EV71-VP1蛋白的表达。（2）自噬和凋亡的作用:WB检测Uro A作用下自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62的表达和凋亡相关蛋白Caspase-3、Cleaved-caspase-3的表达。结果:1、Uro A对EV71增殖的影响（1）通过CCK8试验,≤50μM的Uro A溶液对RD和SK-N-SH均细胞无明显毒性。（2）比较三种不同的Uro A给药方式,当采用感染后给药时,EV71-VP1蛋白表达明显降低,说明感染后给药是一种有效的给药方式。（3）在Uro A有效给药方式下,在RD细胞中CPE现象明显减少,且存活的细胞状态良好,同时EV71-VP1蛋白表达、病毒滴度及病毒复制水平均明显降低;在SK-N-SH细胞中EV71-VP1蛋白表达和病毒滴度也明显降低。2、Uro A抗EV71效果评价（1）细胞毒性评价:Uro A和利巴韦林的CC50分别为133.415±34.385μM,88.410±18.290μM;IC50分别为6.402±1.231μM,8.922±1.129μM;SI分别为20.840μM,9.910μM。可见Uro A对细胞的毒性作用比利巴韦林小。（2）有效性评价:（1）在RD细胞中Uro A组EV71-VP1蛋白表达低于利巴韦林组,且两组均明显低于对照组;而在SK-N-SH细胞中Uro A组和利巴韦林组EV71-VP1蛋白表达无明显差异,但两组均明显低于对照组。（2）随着Uro A和利巴韦林剂量浓度的加大,Uro A组和利巴韦林组EV71-VP1蛋白表达均下降,且Uro A组的抗病毒效果优于利巴韦林组。（3）在Uro A、Uro B、Uro C作用下,EV71-VP1蛋白表达均有不同程度的降低。其中,Uro A抑制EV71增殖的效果最好且毒性最小。3、Uro A抑制EV71增殖的机制探索（1）Uro A和病毒粒子单独或共孵育1h后感染细胞,WB检测EV71-VP1蛋白的表达并无差异。（2）与病毒对照组相比,Uro A组中自噬相关蛋白LC3-II表达增加,p62表达降低;凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白表达无明显差异,Cleaved-caspase-3蛋白表达明显升高。结论:Uro A在体外具有良好的抗EV71效果且较利巴韦林的细胞毒性低。Uro A的抗病毒机制可能和诱导细胞自噬和凋亡有关。
其他文献
目的:构建MTB Hsp16.3重组蛋白,验证其通过CX3CR1调控巨噬细胞M2型极化的作用,生信分析筛选CX3CR1可能作用的靶基因并探讨相关分子机制。方法:1.MTB Hsp16.3重组蛋白的构建:根据NCBI收录的HspX基因序列,在生物信息学分析的基础上设计引物,通过同源重组技术构建HspX基因重组质粒pGEX-4T-GST-Hsp16.3-His,PCR扩增目的序列,进行琼脂糖凝胶电泳鉴
目的:研究使用股骨近端防旋髓内钉（Proximal femoral nail antirotation,PFNA）治疗老年不稳定股骨粗隆间骨折（Unstable intertrochanteric fractures,UIFF）患者术后的隐性失血（Hiddenbloodloss,HBL）与患肢大腿周径变化率及外周血清脂质过氧化损伤的关系,探讨采用患肢大腿周径的变化率早期预测PFNA术后HBL及研究
学生学习兴趣不浓、教师教学形式单一是导致小学语文课堂效率偏低的主要原因。鉴于此，在“双减”背景下，教师应基于网络空间，引领学生扎实学习；利用教学软件，优化课堂教学方法；借助录播教室，同步优质教育资源等。这些信息技术手段的巧妙运用，能够让语文课堂的教学形式更多元、更有趣，让语文课堂的教学效率持续提升。
目的:甄别大鼠结肠肌间神经丛（myenteric plexus,MyP）内的去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）能神经纤维的来源,观察不同来源NE能神经纤维在肠壁内的形态特点和分布范围;研究内源性NE能神经纤维和结肠MyP内其他类型神经元之间的联系和超微结构特点;探讨内源性NE能神经元及其纤维联系对肠道运动功能的影响;为进一步阐明内源性NE能神经元的神经解剖学特点和揭示其功能提供理论
目的:本研究基于蛋白质组学筛选出猪囊尾蚴排泄分泌抗原富含亮氨酸重复序列结构域15（Leucine-Rich Repeat Containing 15,LRRC15）蛋白,经平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）验证后,对其进行真核表达,进一步观察LRRC15蛋白对仔猪T细胞免疫应答的影响。方法:1.将收集和制备的囊尾蚴以及囊尾蚴ESA进行蛋白提取后,经胰酶
目的:恩度（重组人血管内皮抑制蛋白,Recombinant human endostatin,Endostar,YH.16）是晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者广泛应用的抗血管生成药物。本研究旨在回顾性分析恩度联合含铂两药化疗一线治疗IV期NSCLC的安全性和有效性,并与单纯化疗进行比较,为临床应用提供更多依据。方法:收集2012年1月1日至2
目的:观察GPR75受体及其调控下游PLC/PKC信号通路对20-HETE诱导乳鼠心肌细胞凋亡作用的影响,探究GPR75受体在20-HETE诱导心肌损伤中的分子、细胞机制。方法:SD乳鼠心肌细胞原代培养,慢病毒转染敲减心肌细胞GPR75基因表达,心肌细胞随机分为:正常对照组（Control组）、GPR75敲减组（sh GPR75组）和20-HETE处理组（100 nmol/L）;其他组别细胞依据不
目的:揭示眼外肌的肌内神经和肌梭分布规律,探索肌亚部划分;根据肌内神经密集区与肌梭的分布关系,探索肉毒毒素A注射纠正斜视的最佳靶点位置和深度。为亚部化眼外肌移植和注射肉毒毒素A纠正斜视提供潜在的应用解剖学依据。方法:1.标本:无神经肌肉疾病史、头颅及眼部畸形的35～70岁的中国成人头颅30个（男女各半）,其中20个经福尔马林固定,10个为新鲜收集的标本。2.参考线与穿刺角设计:设计内眦为a点,外眦
当前,中国特色社会主义进入了新时代。农村订单定向医学生作为未来基层群众健康的“守门人”,是助推健康中国战略、开创农村医疗卫生事业新局面的生力军,提升农村订单定向医学生职业使命感对发展农村医疗卫生事业尤为重要。本研究聚焦某医科大学全日制本科农村订单定向医学生,探索其职业使命感的结构维度及影响因素,同时揭示其职业使命感的现状,以期拓展职业使命感的研究范畴,丰富职业使命感发展理论,为提升农村订单定向医学
作为城市公共交通的一种补充形式，定制公交可以提供高品质服务，有利于通勤出行，能够缓解城市早晚高峰交通压力，满足多样性出行需求。利用问卷调查，考虑经济性、便捷性、快速性、舒适性、准时性、安全性等服务特性对出行成本的影响，探讨基于出行成本的量化模型。以北京市为例，在路线长度、接驳距离、道路拥堵程度3种情景下，探讨定制公交相对常规公交、城市轨道交通、出租车及私家车的出行成本竞争力。结果表明，定制公交在各