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目的: HBV感染是世界性卫生难题，据世界卫生组织(WHO)2015年公布数据，目前全球有2.4亿慢性乙型肝炎患者，每年有超过78万人死于由乙型肝炎所致肝硬化和肝癌等并发症。 miR-21参与肝脏损伤的修复过程，在急性肝衰竭、部分肝切除后miR-21表达升高，促进正常肝细胞再生，但其本质上是一种充当促癌基因作用的miRNA，参与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭过程。因此，进一步探讨miR-132在慢性HBV感染中对HBV复制、表达及PTEN基因的表达所起的作用是本研究的另一方面。 方法: 1.pmR-21和pmR-132真核重组过表达载体的构建通过miRBase数据库分别查找pre-miR-21（miR-21前体）和pre-miR-132（miR-132前体）序列及其上下游各100bp侧翼序列，用Oligo7软件设计引物。提取HepG2.2.15细胞的DNA作为模板，用PCR扩增前体序列。纯化后的PCR产物经双酶切后分别和pmR-mCherry质粒用T4连接酶于16℃过夜连接。将连接后的产物转化感受态大肠杆菌DH5α，进行卡那霉素抗性平板筛选。16小时后挑取阳性菌落进行菌落PCR和摇菌扩大培养，提取质粒进行双酶切，以1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定重组载体正确性。最后选取电泳阳性组的菌株进行测序鉴定。 2.重组载体转染HepG2.2.15细胞和HepG2细胞 HepG2.2.15细胞培养于含15％ FBS的高糖DMEM培养液中（同时添加200mg/L的G418、10g/L L-谷氨酰胺以及100000IU/L青链霉素），HegG2细胞培养于含10％ FBS和100000 IU/L青链霉素的高糖DMEM培养液中，置于37℃含5％CO2的培养箱内。取经去内毒素提取的重组载体和pmR-mCherry空质粒按试剂盒操作进行转染，分为pmR-21/pmR-132重组载体组、空载体组、空白组、HepG2阳性对照组。转染24h后在荧光显微镜下观察载体荧光蛋白表达效果。 3.流式细胞术检测转染效果 转染24h后，用胰酶消化各组细胞，PBS清洗3次，用加样枪轻轻吹匀后上机检测，激发波长为480nm，检测波长为620nm，设空白组为对照孔。 4.miR-21和miR-132qPCR相对定量检测 转染24h后，收集各组细胞，提取总RNA，以1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。以总RNA为模板，设计针对miR-21、miR-132成熟序列的特异性RT-PCR茎环引物（由广州锐博生物公司设计合成），逆转录后进行qPCR，以U6为内参。采用2△△ct相对定量分析方法检测各组miR-21、miR-132的相对表达量。 5.化学发光法检测培养液上清HBsAg和HBeAg 取转染后24h、48h、72h各组细胞培养上清液（阳性对照组除外），1500rpm离心5min，吸取上清，用化学发光免疫分析仪进行检测。 6.培养液HBV DNA拷贝数检测 收集转染后24h、48h、72h各组细胞培养上清液（阳性对照组除外），1500rpm离心5min，按试剂盒操作处理样品，用定量PCR仪检测。每管设2个复孔。 7.c-myc基因mRNA水平的RT-PCR检测 以总RNA为模板，逆转录成cDNA，以此为模板进行PCR扩增。上游引物为CGTCCTCGGATTCTCTGCTC，下游引物为GCTGGTGCATTTTCGGTTGT。内参为GAPDH，上游引物为:GCTCTCTGCTCCTCCTGT，下游引物为:ATGAGTCCTTCCACGATAC。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳后进行灰度值分析。 8.PTEN基因mRNA水平的RT-PCR检测 以总RNA为模板，逆转录成cDNA，以此为模板进行PCR扩增。PTEN上游引物为:GGGGTGGAACTGTGCACTAA，下游引物为TAGGCTTTGAAGGACAGCAGG。内参为GAPDH，引物同前述。反应结束后PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳和灰度值分析。 9.c-myc/PTEN基因蛋白水平的western blot检测 在转染72小时后提取各组细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度并调节各组蛋白样品浓度至相等，变性后进行SDS-PAGE电泳，半干转至PVDF膜，以浓度为1∶1500的一抗4℃过夜封闭、1∶2000的二抗37℃封闭1小时，TBST洗膜后滴加ECL发光液显影，用灰度值分析条带，计算各组c-myc/PTEN基因的相对表达量。内参为β-actin。 10.CCK-8检测细胞增殖 取转染24h后各组细胞，胰酶消化后接种到96孔板中，每孔1000个细胞，培养液200ul，每组接种4孔，分别于1至4天检测细胞增殖情况。检测时每孔加CCK-8试剂20ul，培养1.5小时后用酶标仪检测各孔450nm吸光值，绘制生长曲线图。每组设三个复孔，所有实验重复3次。 11.统计分析 所有数据描述为均数±标准差，用SPSS20.0软件进行统计学分析，取P＜0.05为有效检验值，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析。 结果: 1.重组质粒验证 菌落PCR产物电泳后可见条带与插入片段大小一致;重组质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳可见质粒大片段和插入的基因小片段两条条带，其中pmR-21重组载体小片段位于300bp与500bp之间，pmR-132重组载体小片段位于500bp与750bp之间，分别与pre-miR-21、pre-miR-132的PCR产物大小一致。最终测序证实pre-miR-21、pre-miR-132基因片段已经插入pmR-mCherry质粒中，pmR-21和pmR-132重组载体构建成功。 2.转染24小时后荧光显微镜下观察载体荧光蛋白表达效果 镜下观察各组细胞形态正常，pmR-21和pmR-132重组载体组、空载体组观察到红色荧光。流式细胞术检测转染效率大于50％。空白组无荧光。 3.qPCR检测miR-21相对表达量 以空白组为1，转染24h后，pmR-21重组载体组HepG2.2.15细胞中miR-21的相对表达量(18.88±2.35)高于空载体组(1.01±0.11)，P＜0.01。空载体组和空白组无差异。 4.qPCR检测miR-132相对表达量 以空白组为1，转染24h后，pmR-132重组载体组HepG2.2.15细胞中miR-21的相对表达量(20.10±2.29)高于空载体组(0.97±0.11)，P＜0.01。空载体组和空白组无差异。 5.转染24h、48h、72h细胞培养液上清HBsAg和HBeAg检测 pmR-21组转染24h、48h、72h细胞培养液上清HBsAg和HBeAg高于空载组和空白组(P＜0.05)，空载组和空白组无统计学差异(P＞0.05);pmR-132组转染24h、48h、72h细胞培养液上清HBsAg和HBeAg低于空载组和空白组(P＜0.05)，空载组和空白组无统计学差异(P＞0.05)。 6.转染后细胞培养液上清HBV DNA拷贝数检测 转染24h、48h、72h，pmR-21组细胞培养液上清DNA拷贝数均高于空载组和空白组(P＜0.05)，空载组和空白组无统计学差异（P＞0.05);在转染24、48、72h后，pmR-132重组载体组HBV DNA定量低于空载体组和空白组，P＜0.01。空载组和空白组无差异，P＞0.05。 7.c-myc基因的mRNA检测 转染24小时后，在内参表达量相当的情况下，空白组和空载体组c-myc mRNA表达量无明显差异，pmR-21重组载体组c-myc mRNA表达量高于空白组和空载组，P＜0.05。 8.PTEN基因mRNA水平检测 以空白组为对照，pmR-132重组载体组在转染24小时后PTEN mRNA表达量高于其余两组(P＜0.05)，空载组与空白组无差异。 9.c-myc基因的蛋白水平检测 western blot显示，与空载体组和空白组对比，pmR-21重组载体组c-myc基因在转染pmR-21重组载体72h表达升高（P＜0.05)，与该基因mRNA检测结果一致。 10.PTEN基因的蛋白水平检测 pmR-132重组载体组PTEN基因在转染pmR-132重组载体72h表达量升高(P＜0.05)，空载组与空白组无差异(P＞0.05)，与mRNA检测结果一致。 11.CCK-8检测细胞增殖 转染后，pmR-21重组载体组细胞生长速度快于空载体组和空白组(P＜0.05)，空白组和空载组无差异(P＞0.05); pmR-132组细胞增殖速度慢于空载体组和空白组(P＜0.05)，空白组和空载组无差异(P＞0.05)。 结论: 1.miR-21和miR-132真核过表达载体pmR-21和pmR-132构建成功。 2.在HepG2.2.15细胞中，miR-21可促进HBV的复制和表达，促进c-myc基因的表达和细胞增殖。 3.在HepG2.2.15细胞中，miR-132可抑制HBV的复制和表达，促进PTEN基因的表达并抑制细胞增殖。