水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一,也是重要的结构及功能基因组研究模式植物。对于水稻功能基因组基础研究及种质创新应用实践而言,有效获得目的基因可靠突变体材料是后续工作能否顺利开展的关键要素,但水稻天然突变体材料的发现、鉴定十分有限,难以满足实际需求。基因组编辑一直是生物学研究的前沿与热点领域,近年来源自(古)细菌基因组的CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPRassociated)基因编辑工具的发展使生物学及其相关学科的基础研究及应用实践发生了革命性变化,相关成果多次被Science、Nature评选为“年度科学突破”(Science:2012,2013,2015)及“杰出研究”(Nature:2019)。研究者先后从不同细菌基因组中挖掘鉴定了CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a(Cpf1)、CRISPR-Cas12b(C2c1)等多种具备不同基因组定向编辑特性的多样CRISPR-Cas系统成员,有效拓展了CRISPR-Cas系统的基础及应用研究范围。尽管作为使用最为广泛的CRISPR-Cas系统成员,Sp Cas9的相关研究工作已经相对较多,但其在植物中的编辑效率、物种适用性、多基因共编辑等关键分子操作依然需要进一步的提质增效。同时,CRISPR-Cas12a作为新报道的2类(class 2)CRISPR-Cas系统成员,在核酸酶蛋白结构、向导RNA构成及核酸分子识别剪切特性等方面相较Cas9有显著不同,显示了其作为基因组编辑工具的巨大潜力。尽管前期相关研究已经证明CRISPR-Cas12a可以作为基因组定向编辑有效工具针对人源及相关动物细胞进行分子操作,但在植物基因组编辑中的编辑效率、编辑特异性、遗传稳定性、适用范围等还没有得到可靠证实。基于以上植物CRISPR-Cas基因组编辑系统创制、升级、应用及水稻定向突变体编辑材料创制的研究现状,本研究围绕CRISPR-Cas9及CRISPR-Cas12a植物基因组编辑新工具构建、活性提升、多位点共编辑有效实现、编辑特异性可靠评价等核心科学问题及关键技术瓶颈展开工作,主要研究结果如下:1、基于序列特异性自剪切核酶,设计了单转录单元CRISPR-Cas9(single transcript unit CRISPR-Cas9,STU-CRISPR 1.0)基因组编辑系统,针对水稻内源基因实现了有效编辑:单位点编辑工作中,农杆菌介导的水稻遗传转化再生T0单株编辑效率为53.8%-100%,其中双等位基因编辑效率为30.8%-77.8%;双位点共编辑工作中,农杆菌介导的水稻遗传转化再生T0单株编辑效率为66.7%-86.2%,其中双等位基因编辑效率为22.2%-89.78%。进一步工作中,分别结合Cas9切口酶、XVE诱导启动系统,证实了STU CRISPR-Cas9系统切口酶编辑及诱导编辑的可行性。同时,基于拟南芥、烟草测试结果,说明STU CRISPRCas9可被广泛应用于不同植物材料基因组编辑中,其编辑效率与Pol II启动子直接相关;2、在STU-CRISPR 1.0系统有效实现的基础上,进一步升级开发了STU-CRISPR2.0基因组编辑新系统。实验结果表明,不同STU-CRISPR 2.0编辑系统均可有效实现目标位点碱基缺失及插入编辑,其中STU-Cas9-Csy4及STU-Cas9-t RNA系统相对STU-Cas9-RZ系统显示了一定程度的编辑活性提升。同时,STU-CRISPR 2.0基因组编辑系统可高效实现针对1-6个目标位点的植物基因组编辑,其中STU-Cas9-t RNA系统在编辑水稻基因组6个位点时,47.4%的T0植株在6个位点均可检测编辑事件发生,值得注意的是10.5%的T0植株在6个位点全为双等位基因共编辑类型。进一步的工作中,基于STU-CRISPR 2.0系统,通过优化r APOBEC1、Pm CDA1胞苷脱氨酶单元,有效实现了C to T碱基编辑。其中稳定转化实验中,STU n Cas9::Pm CDA1可以实现38.9%-68.8%的C to T碱基编辑效率,并且检测到了-1 bp处的C to T单碱基编辑事件;3、针对CRISPR-Cas12a核心元件结构及功能特性,基于ZmUbi1驱动RZ-crRNARZ表达单元的设计策略在水稻中实现了CRISPR-Cas12a核酸酶介导的高效基因组编辑,成功揭示了其植物基因组编辑主要特征:1)编辑事件以6-13 bp的多碱基缺失为主;2)编辑事件主要发生在5’-TTTV-3’PAM位点远端13-22 bp区域内;3)CRISPR-Cas12a核酸酶具备良好的编辑特异性。在水稻稳定植株中,针对Os PDS、Os DEP1、Os ROC5共4个编辑位点处Lb Cas12a的编辑效率为100%,且几乎所有编辑事件均为双等位基因共编辑,同时不存在嵌合体编辑事件。Cas12a核酸酶在编辑活性上存在温度敏感性,但其编辑事件分布特征不会随温度变化而改变。此外,进一步评价了STU-CRISPR策略在Cas12a编辑系统中的适用性,实现了基于STU CRISPR-Cas12a的单位点、多位点基因编辑;4、针对不同类型水稻对照材料及CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a编辑T0、T1代水稻材料进行全基因组重测序(whole genome sequencing,WGS)分析,进行CRISPR-Cas介导的植物基因组编辑特异性定量评价,结果表明:1)CRISPRCas9、CRISPR-Cas12a骨架载体再生植株对照材料全基因组变异事件绝对数量、基因组分布特征与经组培再生及农杆菌侵染再生植株对照材料无显著差异;2)水稻T0代编辑材料中,CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a核酸酶及对应sg RNA、cr RNA的表达并没有增加单核苷酸变异(single nucleotide variant,SNV)、插入-缺失变异(insertion and deletion,Indel)数量;3)不同CRISPRCas表达载体T-DNA插入拷贝数目及单sg RNA、双sg RNA表达载体转化水稻T0代编辑材料间,WGS检出的基因组变异事件绝对数量、分布特征没有显著差异;4)CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a核酸酶编辑效率的不同并不与具体T0代编辑材料基因组变异的产生存在相关性;5)所有CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a编辑事件均可稳定遗传至T1代植株;6)T1代植株中新增变异事件的绝对数量、分布特征对比野生型材料实生苗世代传递产生的基因组自发变异未显示差异;5、基于Prime Editing(PE)实施策略,构建了多类型植物PE基因组编辑新系统:1)PPE3-V01系统中,检测到较低但明确的基于PE策略的编辑活性(0.05%-0.15%),此外还存在较高比例的长片段缺失编辑事件;2)PPE3b-V01系统将最高编辑效率较PPE3-V01提升3倍,进一步实现了编辑位点处多碱基、不连续类型的复杂编辑;3)经基因工程优化后的PPE2-V02及PPE3-V02系统有效提升了水稻内源基因PE编辑效率,最高PE编辑位点效率为1.55%,但不同位点PE编辑效率明显受PBS、RT设计参数影响,同时PPE2-V02及PPE3-V02系统明显降低了非PE策略的删除编辑副产物。