重组绵羊甘露聚糖结合凝集素(MBL)的制备及其对绵羊抗病效果的分析

来源 :石河子大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:ty5004
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甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)又称作甘露糖结合凝集素(mannose-bindinglectin, MBL),在有机体天然免疫系统起着至关重要的作用,通过不依赖抗体的补体激活作用,该蛋白将有机体的补体系统启动,继而发挥免疫调理的作用,因此,它在抵抗病原体感染中具有重要作用。研究发现MBL生物学功能的实现有赖于其完整的蛋白质结构,MBL结构基因突变影响了蛋白多聚体的功能性和稳定性,使得MBL血清浓度明显降低,机体的免疫防御和监视能力削弱,导致机体对多种病原的易感。此外,由于绵羊支原体肺炎难于控制和消灭,并且在新疆较为严重。因此本研究以MBL和绵羊肺炎支原体(Mycoplasma Ovipneumoniae,MO)为研究对象进行了如下实验,以探究MBL与绵羊支原体肺炎及其他传染性疾病的相关性,为今后研发治疗绵羊支原体肺炎的药物提供了理论依据,研究结果如下:(1) ELISA检测中国美利奴羊感染绵羊肺炎支原体的免疫应答变化:选择3只羔羊作为对照组,13只为实验组,在相同饲养条件下人工感染绵羊肺炎支原体,采集攻毒前1d、攻毒后1d、7d、14d、21d的血清,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同个体免疫因子,如TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3的水平。结果显示感染MO后,IFN-γ水平第1d降低,第7d达到最高,即15.13(pg/ml),之后又开始降低,但与攻毒前水平相比仍然较高;TNF-α的水平有所升高,升高幅度较正常对照组不明显,在第14d出现最高水平32.78(pg/ml),但之后降低;C1水平差异不显著;C3水平第1d降低,之后升高,第21天出现最高值12.66(mg/ml)。结论:通过IFN-γ、TNF-α、补体C1、补体C3水平的变化情况,可以推测绵羊患支原体肺炎的程度。(2)人工感染绵羊肺炎支原体后MBL变化及组织病理学分析:感染MO后,ELISA检测MBL水平,并对不同MBL水平的羔羊进行组织病理学评分,以对其肺炎程度进行量化评价,结果显示攻毒前血清MBL水平越高,组织病理学评分越低,所以可得:MBL对绵羊肺炎支原体有一定的抗性。(3)天然、重组绵羊MBL的制备:利用PEG-6000从绵羊血清中提取天然MBL。分别将真核表达载体pPIC9K和克隆载体pMD18-T-MBL经Not I、SnaB I双酶切,然后连接获得重组表达载体pPIC9K-MBL,将其转化毕赤酵母GS115,将获得的天然、重组MBL行SDS-PAGE检测。结果为:天然、重组MBL中均有预测的条带出现。结论:天然MBL中也有非预测的条带,因此获得的天然MBL不纯;重组MBL表达量少,不足以进行后续纯化。(4)细胞、个体水平研究攻毒后,MBL对免疫因子TNF-α和IL-2的影响:感染前实验组分别注射人MBL和羊MBL,结果为:细胞水平上,24h时注射人MBL、羊MBL和实验对照组间TNF-α变化量差异显著,48h、72h时实验对照组和实验组间差异显著,实验组内差异不显著;24h、48h、72h时三者之间IL-2变化量差异显著。个体水平上,羊只感染MO后,第1d到21d三者之间TNF-α变化量差异显著;第7d三者之间IL-2变化量存在显著差异,第14d实验对照组和实验组差异显著,实验组内差异不显著,第21d三者之间差异不显著。结论:MBL增强了免疫系统的抗炎能力。
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