研究背景和目的毒品问题是一个世界性的难题,毒品不仅造成严重的经济损失,更是加速了艾滋病和其他传染病传播,造成严重的社会伦理问题乃至政治问题。有的学者认为阿片类成瘾是一种慢性脑病。阿片类药物极强的成瘾性以及成瘾后戒毒治疗的困难和长期性使得在整个阿片类物质成瘾治疗过程中伴随严重的急性戒断症状。生理脱毒给患者带来严重的生理心理痛苦,往往需要强制,使患者产生严重的对抗情绪,甚至丧失正常理智。因此长时间且有效地缓解急性戒断症状,为患者提供一个舒适的生理脱毒期关系到后续治疗能否继续,将影响整个戒毒治疗成功与否。到目前为止目前国际上常用的毒瘾处置方法仍是用合成的阿片类镇痛药和低成瘾性的美沙酮替代、递减疗法或将一些所谓的“软性”毒品合法化以减少社会问题。更有激进者主张对成瘾患者使用颅内与成瘾相关的神经核团永久毁损的方法来治疗阿片类物质成瘾。而其它治疗方法也仅限于在短时间控制或暂时减轻急性戒断症状。这些措施难使受到毒品长期侵袭的肌体回复到正常,而且导致原来剧烈的急性戒断症状转为慢性稽延性戒断症状。对生理成瘾机制的深入研究提示,内源性β-EP的不足特别是与成瘾相关脑区神经核团β-EP相对不足,是阿片类戒断症状产生的重要神经生物学机制之一,而且可能与情绪心理依赖形成有关。有研究报道,可以通过向中枢直接补充β-内啡肽而减轻戒断症状。但直接补充外源性β-内啡肽的方法存在着有效作用时间短暂和反复多次中枢注射容易造成损伤感染和治疗成本高昂等缺陷。腺病毒载体具有高效地传递和表达基因的能力,但其主要缺点是引起机体的免疫反应,进入体内3-4周后基本消失。然而正是机体的免疫系统逐步清除腺病毒,使靶基因的表达梯度下降,用于急性脱毒治疗时恰好可以提供给机体一个自我调节的时间窗,有利于机体内源性内啡肽物重新达到平衡状态。表达β-EP的重组腺病毒Ad-NEP基因治疗阿片类成瘾可同时满足替代疗法、递减疗法两个层面,因此我们提出使用重组腺病毒Ad-NEP来治疗SD大鼠急性吗啡戒断综合征。这个思路巧妙地利用了腺病毒在其它基因治疗中的缺点,把它的这种会被免疫系统最终清除的特征作为一种避免外来基因长期作用于机体的途径。本课题基于以上思路,从病毒表达产物对离体器官的影响;腺病毒的给药途径、剂量、目的基因在大鼠脑脊液内的表达量与戒断行为学评分指标之间的相关性以及对体重指标变化的影响做了初步探讨。方法一.用皮下注射5日剂量逐步递增法,建立大鼠急性吗啡成瘾模型。二.感染Ad-NEP的HEK293细胞表达的β-EP对急性吗啡成瘾大鼠离体回肠戒断性收缩的治疗作用。1.Ad-NEP和空腺病毒分别感染HEK293细胞,常规培养至第5天,收集上清液。放射免疫分析(RIA)法测定上清液中β-EP浓度,Krebs液稀释上清液20倍,作为实验离体回肠的水浴液。2.实验分四组。A组离体回肠水浴液由Krebs液构成,B组离体回肠水浴液由Krebs液+感染Ad-NEP的细胞上清(含有β-EP)构成,C组离体回肠水浴液由Krebs液+感染空病毒的细胞上清(不含β-EP)构成,D组离体回肠水浴液仍由Krebs液构成。A组为阴性对照组,D组为正常对照组。静息张力Ig平衡30min后,水浴液中加入纳洛酮。颈椎脱臼处死大鼠,取末端回肠制备成1.5cm长短的离体回肠标本。离体回肠基本外环境为37℃、Krebs液水浴液或Krebs液+细胞上清水浴液。所有水浴液均用95%O2+5%CO2混合气体饱和。各实验组测定离体回肠在纳洛酮促发下的前后张力与收缩情况,推断影响各实验组收缩特征变化的因素。三.重组腺病毒Ad-NEP对急性吗啡成瘾大鼠戒断综合症的影响1.筛选适用于大鼠侧脑室注射的病毒剂量。制备5×107、5×108、5×109、5×1010、5×1011PFU五种不同滴度的Ad-NEP溶液30μl,分别注入健康正常大鼠侧脑室,在注射后第4天采集大鼠脑脊液并其中β-EP浓度。另设一组注射生理盐水的正常对照组。统计分析各个不同浓度组以及正常对照组的大鼠脑脊液β-EP浓度值,以病毒滴度对数值与脑脊液β-EP浓度值作相关性分析,推定适合大鼠侧脑室注射的病毒滴度并讨论表达物与所注射病毒滴度的相关性。2.不同剂量Ad-NEP侧脑室注射对急性吗啡成瘾大鼠戒断症状的影响。(1)建立急性吗啡成瘾大鼠模型,随机分为四组:5×1010PFU组、5×109PFU组、Sham组、自然戒断组。除自然戒断组外,其余各组成瘾大鼠均于成瘾第5日晚向侧脑室注射不同滴度Ad-NEP或生理盐水。各组大鼠分别于术后第1、4、8、12天用纳洛酮促发戒断症状,由不知实验分组的人员根据改良的Maldonado戒断症状评分标准对大鼠进行戒断行为学评分,并在评分后立即采集大鼠脑脊液标本以测定β-EP浓度。(2)统计分析各组大鼠观察期内每个标本采集时间点脑脊液中β-EP浓度值、戒断行为学评分的差异以及整个观察期两个指标的变化程度并分析其相关性。(3)观察期内每天测量记录每只大鼠体重,统计分析每组大鼠体重变化的趋势和观察期结束时体重缺失程度的差异。最后各组实验大鼠死亡率行卡方检验。结果一.成功建立急性吗啡成瘾的大鼠活体模型。二.1.获得β-EP浓度为7575pg/mg的细胞培养上清液。2.成功制备了急性吗啡成瘾大鼠的离体回肠标本。尽可能地缩短离体回肠热缺血时间对收缩力的影响。纳洛酮干预前,各成瘾大鼠离体回肠收缩力与正常大鼠离体回肠收缩力相比有统计学差异(P<0.05),提示急性吗啡成瘾大鼠的回肠收缩力高于正常大鼠。纳洛酮干预前后的收缩力,阴性对照组、Krebs液+Ad-NEP感染上清组干预前后收缩力有显著统计学差异(P<0.01);Krebs液+空病毒感染上清组、正常对照组干预前后收缩力无统计学差异(P>0.05)。在观察期内没有观察到纳洛酮对正常大鼠离体回肠引起特异性的戒断性收缩,而其它三组都观察到了戒断性收缩,Krebs液+Ad-NEP感染上清组戒断性收缩的次数明显少于另外两组,数据有显著统计学差异(P<0.01)。提示用含β-EP的水浴液孵育后,可以减轻纳洛酮促发急性吗啡成瘾大鼠离体回肠戒断性收缩的程度和次数。三.1.对于正常大鼠,滴度5×1011PFU剂量病毒注射有较高死亡率,不宜使用。滴度5×109PFU、5×1010PFU两组实验大鼠在注射后第4天脑脊液中β-EP浓度值均高于其他实验组,数据差别有显著统计学差异(P<0.01)。2.经组内单因素方差分析,观察期内两个注射病毒组第4天β-EP浓度值最高,之后开始下降,而Sham组和自然戒断组在第12天达到最高,但远低于两个病毒注射组,数据差异有显著统计学差异(P<0.01)。容量30μl、滴度5×109-10PFU剂量Ad-NEP侧脑室注射可以显著地降低急性吗啡成瘾大鼠在第4天的戒断行为学评分(P<0.01),而另两组则在第12天才有显著下降(P<0.01)。脑脊液β-EP浓度值与大鼠戒断行为学评分间存在负相关,第4天相关性最大,随时间推移相关性减小。实验结束时病毒注射组体重丢失百分比明显少于Sham组和自然戒断组,数据有显著统计学差异(P<0.01);各组大鼠死亡率也有显著统计学差异(P<0.01)。提示Ad-NEP侧脑室注射可以减轻大鼠戒毒期间的体重丢失,也可降低急性吗啡成瘾大鼠自然戒断的死亡率。结论一.重组腺病毒表达的β-EP能有效对抗纳洛酮所促发的急性吗啡成瘾大鼠离体回肠的痉挛性戒断收缩,可在器官水平缓解阿片类戒断综合症。二.容积30μl,滴度5×109-10PFU是比较适合大鼠侧脑室注射的病毒剂量。β-EP浓度值与所注射病毒的滴度对数值呈正相关。此剂量可以使实验大鼠脑脊液获得高浓度β-EP,同时也不会在实验中造成实验大鼠大量死亡。三.侧脑室注射Ad-NEP,可以改善纳洛酮诱发的急性吗啡成瘾大鼠的戒断症状。大鼠急性脱毒早期戒断行为学评分下降与Ad-NEP所引起脑脊液β-EP浓度大幅度增高具有相关性,可能通过补充相关脑区β-EP来起作用,但这种相关性随时间推移而下降,推断在生理脱毒早期脑内相关脑区的β-EP缺失是引起急性戒断综合症的主要矛盾,而后期β-EP角色的重要性下降。