随着牛人工授精技术的广泛推广,种公牛对奶牛群体遗传进展贡献达70%以上,使得高质量的精液品质与经济效益直接相关。正常的精子鞭毛对于精子运动和受精能力必不可少,它涉及到多个具有细胞时空特异性的基因协同表达。因此,鉴定新生公牛与成年公牛睾丸中特异表达的基因及其分子调控机理对于阐明睾丸发育及精子发生的机理至关重要。已有研究表明,SPEF2(Sperm flagella 2.)基因与精子鞭毛的正常发育和男性生殖力密切相关。本试验通过研究SPEF2基因在中国荷斯坦公牛睾丸、附睾和精子中表达,功能性SNPs的鉴定及启动子区甲基化水平分析,以增加对SPEF2基因表达调控机理及其与公牛精液品质的关系的了解,丰富对公牛高繁殖性状形成的分子机理的认识。一中国荷斯坦公牛SPEF2基因可变剪接体鉴定利用RT-PCR、克隆测序在公牛睾丸组织中检测到4种新的SPEF2可变剪接体,分别命名为SPEF2-SV1、SPEF2、SV2、SPEF2-SV3和SPEF2-SV4。Western blot技术检测到SPEF2蛋白在新生公牛和成年公牛心、肝、脾、肺、肾和睾丸组织的表达。IHC揭示了SPEF2蛋白在睾丸的初级精母细胞、伸长的精子和圆形精子中表达。SPEF2参考转录本在成年公牛高精液品质组和低精液品质组中存在差异表达；SPEF2-SV1在除新生公牛肺组织外的其他组织及成年公牛各组织中均有表达,；SPEF2-SV2主要在成年公牛睾丸和附睾中表达；SPEF2-SV3仅在成年公牛睾丸和附睾中表达；SPEF2-SV4表达量很低,各组织中(心、肝、脾、肺、肾、附睾和睾丸)未检测到。因此推测,SPEF2基因表达的不同转录本参与精子发生过程相关。二与可变剪接体相关的功能性SNP(single nucleotide polymorphism)鉴定通过直接测序技术筛选到2个位于潜在外显子剪切增强子内的功能性单核苷酸突变位点(SNPs),c.2851G>T和g.11043C>T。经ESEfinder 3.0软件预测发现,突变位点c.2851G>T(位于外显子20内)增加SRp40剪切因子与靶序列的结合位点,可能导致SPEF2-SV3剪切体的产生,并且与精子畸形率和精子解冻后活力显著相关(P<0.05)。位于第一内含子内的突变位点g.11043C>T改变了剪切因子结合蛋白SC35与靶序列的结合位点,它可能是产生异常转录本(SPEF2-SV4)的重要原因,此SNP与精子畸形率显著相关(P<0.05)。两个突变位点可作为荷斯坦公牛精液品质选择的潜在功能性分子标记。三中国荷斯坦公牛SPEF2基因5’侧翼区核心启动子鉴定及启动子区甲基化分析通过生物信息学预测,在SPEF2基因5’侧翼区预测到一个启动子及一个CpG岛。构建7个缺失片段pGL3重组质粒,瞬时转染MLTC-1细胞,确定了5’侧翼区核心启动子位置位于g.-586～g.-157,而预测到的CpG岛(g.-430～g.-161)正好位于核心启动子区。通过巢式BSP方法获得了该CpG岛序列(271bp),利用克隆测序方法分析了SPEF2基因5’侧翼区核心启动子甲基化水平。结果显示：4头全同胞配对的成年公牛精液CpG岛处于低甲基化状态(<50%的CpG位点发生甲基化),且不同精液品质组之间无差异；4头成年公牛睾丸组织中CpG岛也呈低甲基化状态(平均值：10.26%,n=52 clones).推测精液质量与SPEF2基因5’侧翼区CpG岛甲基化水平无相关性。