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第一部分脂肪来源与骨髓来源的基质干细胞的比较目的比较脂肪来源基质干细胞(ASCs)与骨髓来源的基质干细胞(MSCs)分离效率、表面抗原及免疫原性特点,为ASCs的细胞移植治疗提供实验依据。方法人脂肪组织用胶原蛋白酶Ⅰ消化,对消化后分离的有核细胞贴壁法培养获得ASCs。骨髓组织用密度梯度离心,获得单个核细胞,贴壁法培养获得MSCs,对培养前后的细胞计数并进行比较,流式细胞仪测定两种培养后细胞的CD13、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD49d、CD105、CD106、HLA-DR等表面抗原表达。分别以不同数量细胞加入到外周血混合淋巴细胞培养体系和植物血凝素(PHA)刺激的外周血淋巴细胞转化体系中,用MTT还原法测定细胞增殖,分别观察ASCs和MSCs对混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化的影响,比较两种细胞的免疫特性。同时用乳鼠心肌细胞裂解液诱导ASCs分化为类心肌细胞,并对诱导后的细胞运用免疫组化、RT-PCR方法鉴定,以进一步确定ASCs的干细胞身份。结果从骨髓中刚分离出的有核细胞明显多于来源于脂肪者(P<0.001),但培养后获得的基质干细胞数差别无显著性意义(P>0.05)。两种细胞都表达CD13、CD29、CD44、CD105,均不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR。而在CD49d、CD106的表达上存在差异。相同数量的ASCs和MSCs在混合淋巴细胞反应、淋巴细胞转化实验中对淋巴细胞的抑制作用相当(P>0.05)。诱导培养后的ASCs细胞表达心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、结蛋白(desmin),同时也表达心脏特异性基因cTnT、ANP、αMHC。结论ASCs和MSCs在细胞形态上无明显差别,相同重量的脂肪组织和骨髓组织分离获得的干细胞数量相当。两种细胞表面抗原、免疫原性等方面相似。ASCs可以在体外诱导分化成类心肌细胞。因而人体脂肪可以作为一种充足的干细胞来源加以利用。本研究为进一步利用ASCs进行细胞移植治疗疾病的研究奠定了基础。第二部分脂肪基质干细胞分泌细胞因子及其对内皮细胞的作用目的分离培养脂肪基质干细胞(ASCs),探讨其分泌的细胞因子及其对内皮细胞增殖及凋亡影响的生物活性作用。方法人脂肪组织用胶原蛋白酶Ⅰ消化后贴壁法培养获得ASCs,流式细胞术鉴定其表面抗原CD31、CD44、CD45、CD105的表达情况。ELISA法测定ASCs分泌的细胞因子:血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)等,RT-PCR法测定相应mRNA表达。从人脐静脉分离并培养内皮细胞后,加入含ASCs上清液的培养液(实验组)或常规培养液(对照组)继续培养3天后,细胞计数测定内皮细胞的增殖。另有实验组及对照组加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导内皮细胞凋亡后,将内皮细胞行PI与annexin V双染色后流式细胞仪测其凋亡率。并半定量RT-PCR法测定并比较两组ASCs中Bcl-2 mRNA表达情况。结果培养获得ASCs,表型为CD34+CD105+CD31-CD45-,细胞培养上清中测得各细胞因子的含量为:VEGF ,(75±16) pg/ml; HGF ,(637±157) pg/ml;SDF-1α,(482±113) pg/ml。RT-PCR法测得ASCs表达VEGF、HGF、SDF-1α的mRNA。含ASCs上清培养液的实验组内皮细胞数为(134±19)%,显著高于对照组(97±12)%(P<0.05),证明ASCs上清能促进内皮细胞的增殖。TNF-α诱导凋亡24小时后,对照组内皮细胞凋亡率(6.9±1.7)%高于实验组(3.1±1.2)%,(P<0.05)。进一步测定发现,实验组bcl-2的mRNA表达明显上调(P<0.05)。结论ASCs能分泌VEGF、HGF、SDF-1α等细胞因子,并因此促进内皮细胞的增殖,抑制内皮细胞的凋亡。其抑制凋亡作用和上调细胞的bcl-2 mRNA表达有关。第三部分脂肪基质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死目的探讨大鼠脂肪基质干细胞(ASCs)移植于大鼠梗死心肌后的增殖分化情况及对心功能的影响。方法Sprague-Dawley(SD)大鼠脂肪组织用胶原蛋白酶Ⅰ消化,贴壁法培养获得ASCs,流式细胞术鉴定其表面抗原CD31、CD44、CD45、CD90的表达情况。将SD大鼠左前降支结扎制造急性心肌梗死模型后,在梗死心肌处植入DAPI标记ASCs(实验组)或DMEM培养液(对照组)。移植后1wk及4wk,超声多谱勒检查并计算左室短轴缩短率(FS)、左室射血分数(LVEF)等以评价心功能。并取梗死区心肌组织行冰冻切片,应用免疫组织化学的方法进行移植细胞形态学检查,观察移植ASCs向内皮细胞、心肌细胞的分化情况并进行毛细血管密度测定。RT-PCR、ELISA法测梗死区VEGF的mRNA及蛋白表达情况。结果培养获得ASCs,表型为CD44+CD90+CD31-CD45-。植入梗死区的ASCs可以分化为血管内皮细胞,实验组梗死心肌处血管密度在移植后1wk及4wk较对照组均明显增高(P <0.01),并且VEGF基因及蛋白水平在移植后1wk及4wk均较对照组明显增高(P <0.01)。移植后4wk,实验组大鼠LVEF及FS较对照组明显提高(P <0.01)。结论ASCs移植可以促进大鼠梗死后心肌血管新生,改善心功能。