背景:大骨节病(Kachin Beck disease,KBD)是一种以软骨坏死为主要改变的地方性变形性骨关节病,流行于我国从东北到西南的地带中,患病率和致残率很高。自1849年俄罗斯Yurenski报道KBD以来,其发病机制至今仍不清楚。目前,对KBD病因发病机制的研究不仅局限于流行病学、病理学、环境因素(低硒、T 2毒素等)及防治等方面,且已涉及到细胞凋亡及其调控因子、差异基因和差异蛋白表达等。骨性关节炎(Osteoarthritis, OA)是以关节软骨退变为主要特征,导致关节疼痛和功能障碍的疾病,好发于膝、髋等负重关节,常见于60岁以上的老年人群,与KBD好发于3 12岁儿童、软骨发育障碍、关节增粗畸形等继发性骨关节炎有着显著的不同。然而,这两类疾病均以关节软骨损伤为特征,严重影响成人的劳动力和生活质量。近年来,随着对OA发病机制的深入研究,证实软骨细胞凋亡、细胞因子信号转导障碍等是造成OA软骨损伤的重要原因之一。是否KBD的软骨损伤也涉及到软骨细胞凋亡及细胞因子信号转导障碍,以及两者之间有何区别,有待进一步阐明。目前,KBD病因发病机制中存在问题很多,但急需解决的主要问题有:①发病原因是单一因素还是环境基因相互作用所致?②KBD和OA关节软骨在分子生物学水平上有何不同?③在基因水平KBD究竟发生了怎样的变化,其与OA有何区别和联系?④硒预防和治疗KBD软骨细胞的机制是什么?为此,本论文主要对比研究了KBD与OA软骨细胞凋亡信号转导、差异基因表达及补硒干预,以阐明这两类关节疾病在软骨细胞凋亡、基因表达、以及补硒对凋亡影响等方面的差异,为深入探讨KBD的病因发病机制、KBD与OA发病机制的异同,提高KBD防治效果,提供科学依据。目的:1.通过体外培养KBD和OA的关节软骨细胞,比较软骨细胞生长增殖、形态结构特性、细胞凋亡及其信号转导通路的异同;2.采用Agilent Human 1A基因表达谱芯片比较KBD和OA关节软骨表达基因,以筛选和确定KBD不同于OA的特征性基因;3.通过不同浓度补硒,体外干预软骨细胞,探讨硒对KBD、OA和正常软骨细胞生长和细胞凋亡的影响。方法:1.将病例分为三组:KBD组,OA组和正常对照组。正常对照组和OA组选自非KBD病区,KBD组的病例选自KBD病区,年龄均在49 65岁之间。根据我国颁布的KBD病临床诊断标准,选择Ⅱ度和Ⅲ度病例;根据WOMAC诊断标准选择OA病例,排除诸如遗传性骨病,类风湿性关节炎等。在患者知情同意的情况下,软骨取材主要来自膝关节部位,并在年龄和性别等方面达到匹配。2.在无菌条件下,体外培养KBD、OA和正常软骨细胞,运用MTT法、流式细胞仪、电镜、免疫荧光、激光共聚焦和免疫组化等实验方法,对比KBD、OA和正常软骨细胞生长特性和细胞凋亡途径的不同;对三组软骨细胞进行补硒干预,比较不同浓度硒(0.0125 g/ml～1.0 g /ml)对KBD和OA细胞生长和凋亡的影响。3.提取KBD和OA关节软骨细胞RNA,运用Agilent Human 1A基因表达谱芯片技术,用间接标记方法,获得荧光标记的cRNA靶物,进而与基因芯片杂交,通过FeatureExtraction9.3、Spotfire 8.0和Genepix 3.0等软件,选择P<0.05的具有明显表达差异的基因,以筛选KBD不同于OA的特征性基因。结果:1. KBD和OA凋亡和信号转导通路的对比研究1)KBD和OA组软骨细胞的增殖率、平均生长率显著滞后于正常对照组,其中KBD软骨细胞增殖率高于OA组。KBD软骨细胞超微结构以细胞膜形态不规则、细胞核扭曲变形、细胞膜内糖原边集、细胞膜糖原释放、高尔基体和线粒体肿胀为主,而OA组则以细胞肿胀、软骨细胞电子密度增加、细胞膜绒毛减少、胞浆内大量游离脂滴、高尔基体和内质网肿胀为主。2)KBD和OA的软骨细胞凋亡显著高于正常组,细胞增殖周期G2/M期比例增高;Fas、Bax、Caspase 3、Caspase 9和P53表达上调;KBD软骨细胞Caspase 8和P53表达低于OA,而Caspase 9表达高于OA。3)KBD和OA具有相似的细胞凋亡途径,与OA相比,KBD更倾向于线粒体凋亡途径。2. KBD和OA关节软骨差异基因比较及生物通路模型的构建在KBD与OA四组病例中筛选出显著差异的基因233个,其中共同上调的基因195个,共同下调的基因38个。根据其生物学功能分类,证实筛选出的基因中CSGALNACT、PIM2、EFNA1、SMAD 9、STK11、AQP、T cell factor/LEF、PTN,APCDD1和CAV等对KBD发生发展具有重要意义,主要涉及软骨代谢、离子通道蛋白、凋亡等多方面的基因,构建出与氧化应激、氨基酸代谢、脂代谢等相关的通路模型。3.不同浓度硒含量干预对KBD和OA软骨细胞生长和凋亡的影响1)当Se浓度>0.05 g/ml时能显著损害正常软骨细胞的生长,但Se浓度<0.025 g/ml时仍对正常细胞的生长有损伤;尽管Se浓度>0.50 g/ml对KBD软骨细胞生长有一定的毒性作用,但在0.25 0.10 g/ml之间可促进KBD软骨细胞的生长,细胞保持增殖状态;对于OA软骨细胞,Se浓度>0.50 g/ml对细胞增殖有毒性作用,Se浓度<0.25 g/ml细胞能够保持较高增值率,硒也有一定的保护作用。2)加硒后对正常软骨细胞生长具有毒性作用,其损害程度随加硒浓度的增高而加重;对于KBD而言,加入0.50 g/ml～1.0 g/ml硒含量对细胞生长有毒性作用,0.10 g/ml～0.25 g/ml之间为促进生长,而加入<0.05 g/ml则细胞增殖能力下降;对于OA,加入0.50 g /ml～1.0 g/ml的硒对细胞生长有毒性作用,而Se<0.25 g/ml对细胞的增殖则有促进作用。3)补硒对软骨细胞超微结构影响的结果显示,Se<0.10 g/ml对KBD,Se<0.05 g/ml对OA的软骨细胞损伤不显著,而Se>0.025 g/ml对正常软骨细胞的亚微结构有影响。4)加入不同浓度硒时,正常软骨细胞的凋亡率显著高于不加硒的对照组;KBD组除高浓度硒(>0.25 g/ml)产生较高的凋亡率外,补硒可降低软骨细胞的平均凋亡率;在OA组,除引起较高的软骨细胞凋亡率的硒浓度(>0.25 g/ml)外,一定浓度的补硒也可降低软骨细胞凋亡率。5)加入一定浓度的硒对KBD和OA软骨细胞凋亡调控蛋白表达(Fas、Bax、Caspase 3、Caspase 9、P53)有抑制作用,其中补硒对KBD软骨细胞的保护作用高于OA,而对正常软骨细胞有程度不同的损伤作用;三组之间保护软骨细胞的适宜硒浓度不一。结论:1. KBD和OA的关节软骨细胞凋亡率显著高于正常对照组,且Fas、Bax、Caspase 3、Caspase 9、P53表达增高;其中KBD软骨细胞Caspase 8和P53表达低于OA,而Caspase 9表达则高于OA;KBD超微结构变化类似于OA,但其线粒体凋亡途径损伤较OA更明显。2. KBD差异表达基因不同于OA,其中显著差异的233个基因中KBD下调的基因38个,上调的基因195个,主要涉及CSGALNACT、PIM2、EFNA1、SMAD 9、STK11、AQP、T cell factor/LEF、PTN、APCDD1和CAV等反映代谢、离子通道蛋白、凋亡等多方面的基因。3.保护KBD和OA的适宜硒浓度不同,在相同补硒剂量下,对KBD保护作用高于OA,但对正常软骨细胞有不同程度的损伤作用;超出适宜的补硒浓度,对三组软骨细胞均具有毒性损伤作用。