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【研究背景与目的】同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)诱导神经细胞死亡在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的病理进展中具有重要作用。硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)是一种内源性神经保护剂，具有抗氧化、抗凋亡作用。本课题组的以往研究发现H2S能够拮抗Hcy的神经细胞毒性，但其机制尚未阐明。脑源性神经营养因子(Brain derived neurophic factor, BDNF)是由神经元分泌的，在神经细胞的分化、存活、发育中起到重要作用。作为Sirtuins家庭中的一员，沉默信息调节因子(Silent information regulator, SIRT1)在大脑、小脑及海马中均有表达，对于调节细胞的新陈代谢、衰老等起到重要作用。因而，我们将从BDNF和SIRT1的角度探讨H2S拮抗Hcy神经毒性的机制。为此，本实验以侧脑室注射Hcy的SD大鼠为Hcy神经毒性的动物模型，探讨H2S对Hcy损伤海马神经元的拮抗作用以及BDNF/TrkB通路和SIRT1对H2S抗Hcy损伤海马神经元的介导作用。【方法】Tunel (Terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-endlabeling)法分析大鼠海马CA1区神经元的凋亡情况；Western blotting检测大鼠海马组织糖调节蛋白78(Glucose regulated protein78, GRP78)，C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)以及cleaved caspase-12等内质网(Endoplasmic reticulum, ER)应激相关标志蛋白的表达；Elisa法测试大鼠海马组织中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的含量。【结果】1.同型半胱氨酸诱导大鼠海马神经元损伤Tunel染色结果显示Hcy (0.6,2.0μmol/d×7d, icv)可诱导海马CA1区神经元凋亡，表明Hcy可诱导海马神经元凋亡。Western blotting检测ER应激相关标志蛋白(GRP78, CHOP and cleavedcaspase-12)表达水平，结果显示Hcy (0.2,0.6,2.0μmol/d×7d, icv)可浓度依赖性地增加大鼠海马GRP78，CHOP以及cleaved caspase-12蛋白的表达，表明Hcy可引起大鼠海马ER应激。Elisa法检测大鼠海马组织MDA的含量，结果显示Hcy (0.2,0.6μmol/d×7d, icv)可增加大鼠海马MDA含量，表明Hcy可诱导大鼠海马氧化应激。2.硫化氢拮抗同型半胱氨酸诱导的大鼠海马神经元损伤Tunel染色结果显示NaHS (100μmol/kg/d×9d, ip)改善了Hcy (0.6μmol/d×7d,icv)导致海马CA1区神经元的凋亡，表明H2S可拮抗Hcy诱导海马神经元凋亡。检测大鼠海马组织ER应激相关标志蛋白(GRP78, CHOP and cleavedcaspase-12)表达水平，结果显示NaHS (100μmol/kg/d×9d, ip)能明显抑制Hcy(0.6μmol/d×7d, icv)导致大鼠海马GRP78，CHOP以及cleaved caspase-12蛋白表达的增加。上述结果表明H2S可抑制Hcy诱导大鼠海马ER应激。检测大鼠海马组织MDA的含量，结果显示NaHS (100μmol/kg/d×9d, ip)显著降低Hcy (0.6μmol/d×7d, icv)引起海马MDA水平的增加，表明H2S能减轻Hcy诱导大鼠海马氧化应激。3. BDNF/TrkB通路抑制剂K252a逆转硫化氢对同型半胱氨酸诱导大鼠海马神经元损伤的拮抗作用Tunel染色结果显示BDNF受体酪氨酸蛋白激酶B (TrkB)的特异性抑制剂K252a(1μg/d×9d, icv)能明显逆转NaHS (100μmol/kg/d×9d, ip)对Hcy (0.6μmol/d×7d, icv)诱导海马CA1区神经元凋亡的抑制作用，表明BDNF/TrkB通路参与H2S对Hcy诱导海马神经元凋亡的拮抗作用。Western blotting结果显示K252a (1μg/d×9d, icv)能明显逆转NaHS (100μmol/kg/d×9d, ip)对Hcy (0.6μmol/d×7d, icv)导致大鼠海马GRP78，CHOP以及cleaved caspase-12蛋白表达增加的抑制作用。上述结果表明BDNF/TrkB通路参与H2S抑制Hcy诱导海马ER应激。检测大鼠海马组织MDA的含量，结果显示K252a (1μg/d×9d, icv)能明显逆转NaHS (100μmol/kg/d×9d, ip)对Hcy (0.6μmol/d×7d, icv)引起海马MDA水平增加的抑制作用，表明BDNF/TrkB通路参与H2S对Hcy诱导海马氧化应激损伤的改善作用。4. SIRT1抑制剂Sirtinol逆转硫化氢对同型半胱氨酸诱导大鼠海马神经元损伤的拮抗作用Tunel染色结果显示SIRT1的特异性抑制剂Sirtinol (10nmol/d×9d, icv)能明显逆转NaHS (100μmol/kg/d×9d, ip)对Hcy (0.6μmol/d×7d, icv)诱导海马CA1区神经元凋亡的抑制作用，表明SIRT1参与H2S对Hcy诱导海马神经元凋亡的拮抗作用。Western blotting结果显示Sirtinol (10nmol/d×9d, icv)能明显逆转NaHS (100μmol/kg/d×9d, ip)对Hcy (0.6μmol/d×7d, icv)导致大鼠海马GRP78，CHOP以及cleaved caspase-12蛋白表达增加的抑制作用。上述结果表明SIRT1参与H2S抑制Hcy诱导大鼠海马ER应激。检测大鼠海马组织MDA的含量，结果显示Sirtinol (10nmol/d×9d, icv)能明显逆转NaHS (100μmol/kg/d×9d, ip)对Hcy (0.6μmol/d×7d, icv)引起海马MDA水平增加的抑制作用，表明SIRT1参与H2S对Hcy诱导海马氧化应激的改善作用。【结论】1．H2S可拮抗Hcy对海马神经元的损伤作用。2．BDNF/TrkB通路和SIRT1参与H2S对Hcy损伤海马神经元的保护作用。