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癫痫是临床上一种常见的慢性疾病,起病年龄跨阈大,以发作形式多样、反复发作为特点,对患者身体、精神、智力等均造成不同程度的影响,临床上可表现为多种癫痫综合征,也可演变为癫痫持续状态,甚至引起癫痫性猝死。癫痫的致病机制复杂,至今仍未阐明,由相关基因突变引起的细胞功能障碍可能为其致病原因之一。此外,近年来,组学技术在医学领域被越来越广泛地使用,作为其重要组成部分的蛋白质组学的迅速发展为临床上疾病标志物的识别、疾病的早期诊断、靶向干预提供了有力的技术支持。但是目前对癫痫的蛋白质组学研究多集中于动物模型或人脑组织标本,对于癫痫血浆蛋白质组学的研究仍不多见。本研究一方面应用定量蛋白质组学联合生物信息学技术对癫痫患者血浆差异蛋白进行筛选,一方面通过体外细胞实验对癫痫致病基因CACNA1A扩增突变引起细胞凋亡的机制进行研究。本文共分6章,主要内容在第3、4章,具体工作如下:⒈儿童Rolandic癫痫血浆TMT定量蛋白质组学分析（第3章）目的:应用TMT定量蛋白质组学技术对儿童Rolandic癫痫患者血浆中的差异表达蛋白进行分析,同时联合生物信息学技术对差异蛋白进行筛选、可视化,以寻求癫痫患者血浆中的可能生物标志物。方法:对儿童Rolandic癫痫患者（病例组5例）及儿童偏头痛患者（对照组5例）的血浆分别进行收集,之后进行蛋白提取及胰蛋白酶酶解消化,酶解后的肽段用TMT试剂进行标记,再用高效液相色谱法（HPLC）分级,液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析,使用Maxquant（v1.5.2.8）进行检索,检索数据库为Swiss Prot Human,进行差异蛋白鉴定。在质谱数据质控检测合格的基础上,选取fold change>1.2或fold change<0.83,P value<0.05,且同时在二组或以上均表达上调/下调的差异表达蛋白（DEP）进行生物信息学分析:包括GO分析、KEGG通路分析、蛋白互作（PPI）网络的构建、差异表达蛋白的核心基因筛选。结果:共鉴定到752个蛋白（670个定量蛋白）。其中217个差异表达蛋白存在于二组及以上的样本中,其中上调差异表达蛋白46个,下调差异表达蛋白111个。这些蛋白多与免疫或炎症反应、补体级联反应的活化、脂质及糖酵解代谢、纤维蛋白原及纤溶系统的调节异常、氧化应激反应有关。共筛选出20个核心差异表达蛋白,其中纤连蛋白、α-1酸性糖蛋白家族（AGP1、AGP2）、血清淀粉样蛋白P、纤维蛋白原γ链、纤维蛋白原α链、补体C9、补体C8β、补体C4B、补体因子I表达上调;甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、磷酸丙糖异构酶（TIM）、磷酸甘油酸激酶1（PGK1）、果糖二磷酸醛缩酶A（ALDOA）、蛋白质二硫键异构酶（PDI）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物岐化酶1（h Sod1）、热休克蛋白90β1、α稀醇化酶、载脂蛋白A1表达下调。α-1酸性糖蛋白（AGP）、血清淀粉样蛋白P（SAP）在儿童Rolandic癫痫患者血浆中表达上调属首次报道。⒉PME基因CACNA1A中CAG扩增突变引起SH-SY5Y细胞凋亡的机制研究（第4章）目的:我们课题组前期在一个进行性肌阵挛癫痫（PME）伴有进行性共济失调、肌张力减退及认知功能下降的三代家系中发现二例CACNA1A基因纯合突变,为47外显子c.69756976ins CAG。本章是探讨PME致病基因CACNA1A的3′端CAG扩增突变对SH-SY5Y细胞凋亡的影响,进而为PME发病机制的研究提供依据。方法:⑴构建表达Cav2.1wt（Q13）、Cav2.1mt（Q26）、截短突变（Cav2.1dm）中的Cav2.1N、Cav2.1dm1、Cav2.1dm2、Cav2.1C、Cav2.1dm3、Cav2.1dm4、Cav2.1dm5的DNA分子,并将相应的DNA分子克隆到带有Bam H I和Xba I限制性内切酶切位点的pc DNA3.1 neo vector中。再利用Lipofectamine 3000进行SH-SY5Y细胞转染。⑵48小时后采用WST-1细胞增殖试剂盒进行细胞增殖检测,并利用流式细胞学进行细胞周期及凋亡检测,并观察细胞凋亡形态。⑶用GFP标记Cav2.1dm3构建Cav2.1dm3G融合基因,应用western blot检测转染后细胞中Cav2.1wt、Cav2.1mt、Cav2.1dm3G的蛋白表达情况,并应用免疫荧光及DAPI染色观察Cav2.1wt、Cav2.1dm3G表达蛋白在细胞中的分布。⑷应用western blot检测转染后Cav2.1wt、Cav2.1mt、Cav2.1dm3各组中Bcl-2、Bax、cleaved caspase 3、cleaved PARP的蛋白表达水平。结果:⑴与Cav2.1wt（Q13）及EV对照组相比,Cav2.1mt（Q26）显著降低了细胞的增殖水平,**P<0.01。Cav2.1N、Cav2.1C与EV对照组相比,未见对细胞增殖产生显著性影响。Cav2.1dm3与Cav2.1dm1、Cav2.1dm2组分别相比较,对细胞增殖的抑制差异均具有显著性,**P<0.01。Cav2.1dm4、Cav2.1dm5与EV对照组相比,未见对细胞增殖产生显著性影响。Cav2.1dm3与EV对照组、Cav2.1dm4、Cav2.1dm5组分别相比较,对细胞增殖的抑制差异均具有显著性,**P<0.01。⑵Cav2.1mt、Cav2.1dm3与EV对照组、Cav2.1wt组相比,对细胞周期分布的影响无显著性差异。⑶Cav2.1dm3与Cav2.1wt、EV对照组相比,引起细胞凋亡百分比的升高具有显著性差异,**P<0.01。Cav2.1dm3与Cav2.1mt组之间相比较,引起细胞凋亡百分比的升高具有显著性差异,**P<0.01。⑷western blot结果显示,Cav2.1wt蛋白主要表达于细胞膜（87.0%,**P<0.01）,Cav2.1mt蛋白表达于细胞膜和细胞核（46.7%vs53.3%,**P<0.01）,而Cav2.1dm3G蛋白主要表达于细胞核（85.9%,**P<0.01）,与细胞免疫荧光染色实验结果一致。⑸与Cav2.1wt组相比,Cav2.1mt和Cav2.1dm3组Bcl-2/Bax比值的下降、cleaved caspase 3、cleaved PARP水平的升高具有显著性差异,**P<0.01。Cav2.1dm3组与Cav2.1mt组相比,Bcl-2/Bax比值的下降、cleaved caspase 3、cleaved PARP水平的升高具有显著性差异,**P<0.01。结论:⑴应用TMT定量蛋白质组学技术从儿童Rolandic癫痫患者血浆中筛选出的蛋白,多数与免疫或炎症反应、补体级联反应的活化、脂质及糖酵解代谢、纤维蛋白原及纤溶系统的调节异常、氧化应激反应有关。⑵应用生物信息学方法共筛选出20个核心差异表达蛋白,其中与免疫或炎症反应、补体级联反应的活化、纤维蛋白原活化相关的蛋白表达上调;与脂质及糖酵解代谢、纤溶系统调节异常、氧化应激反应相关的蛋白表达下调。α-1酸性糖蛋白（AGP）、血清淀粉样蛋白P（SAP）在儿童Rolandic癫痫患者血浆中表达上调属首次报道。⑶癫痫致病基因CACNA1A中CAG扩增突变所编码的C端含有延长的poly Q序列的突变型Cav2.1蛋白可能由于结构不稳定发生酶解,产生截短突变蛋白,其中包含有C端的截短蛋白更倾向于发生核转移,并可通过Bcl-2/Bax/caspase-3/PARP通路诱导SH-SY5Y细胞凋亡。