背景：虽然目前疾病治疗仍然以手术，化疗及放疗为主，但基因治疗作为一种治疗疾病的新手段愈来愈受到人们的重视，随着基因治疗相关技术的成熟，该技术必将成为继手术、化疗及放疗之后另一种重要的疾病治疗手段。现阶段制约基因治疗应用的主要因素包括缺乏高效的目的基因及靶向转运目的基因的载体。目前基因转运方法有许多种，其中包括物理方法、化学方法，融合法，基因枪等。上述各种基因转移方法虽各有许多优点，但因效率都比较低。较难获得稳定表达的细胞。腺病毒载体由于具有宿主广泛、能制备高滴度病毒、感染效率高、高表达目的基因、能感染增殖及静止两类细胞、不与宿主细胞基因组DHA整合、容许插入大片断外源基因等特点而受到人们的青睐。但因其感染特异性不强，很难局限感染病变部位，而且有些细胞如血管内皮细胞、平滑肌细胞、造血细胞等对腺病毒感染具有天然的抵抗性。因此，限制了该载体在基因治疗中的应用。腺病毒纤维蛋白在腺病毒粘附到靶细胞的过程中起关键作用，通过改造纤维蛋白可增加腺病感染的特异性、扩展其亲嗜性、增加基因 汕头大学医学院博士学位论文 转染效率。肿瘤血管与肿瘤的生长、浸润、转移及预后密切相关。 肿瘤血管内皮细胞本质上仍为正常内皮细胞，不存在耐药问题，各 叹 种肿瘤血管内皮细胞也无本质区别，而且肿瘤血管内皮细胞表达谱二 与正常血管内皮细胞存在一定差异。困而，肿瘤血管内皮细胞为肿 瘤治疗提供了诱人的靶部位。但腺病毒载体对肿瘤血管内皮细胞无 感染性，为增强其转染肿瘤血管内皮细胞的能力，必须对腺病毒载 体进行改建。 目的：克隆5型腺病毒纤维蛋白基因，为构建靶向性腺病毒载体创造条件； 改造腺病毒纤维蛋白knob 区，构建纤维蛋白突变体，检测其与血 管内皮细胞的结合持性；将能与血管内皮细胞特异结合的纤维蛋白 突变体插回到腺病毒基困组中，包装成重组腺病毒载体，验证其与 血管内皮细胞特异结合的能力及转染效率。 方法：（1）应用限制性内切酶技术克隆纤维蛋白（Fiber）基因，并构建其 真核、原核表达载体，变性及非变性 SDS一PAGE、Western blot分 析所表达纤维蛋白的结构；（2）定点突变技术在 Fiber基因 Knob区 HI环插入厂COR Vd点，然后在该位点插入 贴R基序（突变体称 作F．NGR＊ 并构建其真核、原核表达载体。变性及非变性SOS－ PA G E、Western blot分析所表达突变纤维蛋白的结构；（3）定点突J 变技术在Fiber及刀．NGR第4 08位氨基酸处引入点突变（突变体 称作 F408及FNGR408），并构建其真核、原核表达载体。变性及 卜变性 SDS－PAGE、Western blot分析所表达突变纤维蛋白的结构； （4）TALONspin蛋白纯化柱纯化诱导表达的纤维蛋白及其突变体； （5）免疫细胞化学检测纤维蛋白及其突变体与靶细胞的结合特性； 3 汕头大学医学院博士学位论文 免疫细胞化学检测纤维蛋白及其突变体与靶细胞的结合特性；（6） 基困重组技术构建纤维蛋白拯救质粒；（7）刀．NGR与纤维蛋白拯救 质粒共转化重组菌，进行细菌内0M同源重组，刀．＊＊R得以插回到 腺病毒骨架质粒；（8）腺病毒穿梭质粒与重组骨架质粒在细菌内进 行同源重组，获重组腺病毒质粒；（9）切取重组腺病毒基因组洲A， 脂质体转染法将其转运到HEK293 包装细胞内；（10）绿色荧光蛋白 uFP）监测腺病毒载体包装、扩增及滴度测定；门）重组腺病毒感 染靶细胞，流式细胞仪检测荧光细胞百分数及平均荧光强，推算重 组腺病毒转染靶细胞的能力。 结果：（1）成功克隆纤维蛋白基困，其大小在变性奈件下为62k厂而在非 变性条件下为186k0，具有三聚体结构，可用于靶向性构建；（2） 经内切酶酶切及测序证实 F．NGR HI环 rs一6、r547之间已成功插入 N G R基序，并保留有三聚体结构；（3）测序证实 F．408 A F．NGR408 中 r408位点由丝氨酸置换为谷氨酸，而且两者均保留三聚体结构； （4）Fiber、F．NGR能与 C A R阳性细胞结合，而 E408、刀．NGR408 则不能与 C A R阳性细胞结合