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阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）是最常见的痴呆症之一,研究并阐明AD的病因和发病机制,具有重要的社会意义和科学价值。神经原纤维缠结(Neurofibrillary Tangles，NFT)是AD的特征性病理学改变之一，与AD的临床痴呆严重程度正相关。NFT的主要成分为成对螺旋丝(Paired Helical Filaments，PHF)，由异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau组成。Tau的异常磷酸化使其丧失促微管组装和稳定微管的功能,在AD的发生、发展中起关键作用。作为一种磷蛋白,tau的磷酸化程度由相关的蛋白激酶/蛋白磷酸酯酶共同作用决定,在众多参与tau磷酸化修饰调节的酶中,蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性下调在tau蛋白异常过度磷酸化中起关键作用，然而PP2A活性下调的原因和机制还远未阐明。有报道在体外实验中，PP2A催化亚单位（PP2Ac）酪氨酸307（Y307）位点的磷酸化可使PP2A活性显著下降。但是对AD病人脑内及细胞内PP2Ac（Y307）位点的磷酸化修饰以及其与PP2A活性和AD发病的关系，目前尚未见任何报道。
本研究中，采用特异性针对Y307位点磷酸化的PP2A的抗体，通过免疫组化，激光共聚焦，免疫印迹等方法，系统研究了AD脑内PP2A的酪氨酸磷酸化修饰及其与AD相关病变和可能危险因子如淀粉样蛋白Aβ沉积，雌激素缺乏和锌离子聚集等之间的关系。其结果如下:
(1) AD脑内PP2A的酪氨酸磷酸化修饰:免疫组化和激光共聚焦研究结果显示，酪氨酸307磷酸化的PP2A(PP2Ac-Yp307)在AD易感脑区如内嗅皮质、海马等异常聚集于已有神经原纤维缠结和即将发生神经原缠结的神经元，且Yp307磷酸化的PP2Ac与磷酸化的tau蛋白共定位，二者的磷酸化水平呈正相关。
(2) Aβ沉积与PP2Ac（Y307）位点的磷酸化修饰的关系：(i) 在稳定表达人类瑞典突变的淀粉样前体蛋白(APPswe)的小鼠成神经瘤细胞（N2a）中，tau发生过度磷酸化，同时，PP2Ac-Yp307的水平增高；(ii) 同样的改变也见于APPswe/ presenilin(PS1，A246E)转基因鼠脑中；(iii) 用Aβ25-35处理野生型N2a细胞，可模拟N2a APPswe细胞内tau和PP2Ac-Yp307的改变。
(3)在雌激素受体α或β(ERα or ERβ)基因敲除的小鼠脑内，PP2Ac-Yp307和tau的磷酸化水平同时升高。(4)用硫酸锌处理培养的野生型N2a细胞和大鼠脑组织活片，PP2Ac-Yp307和tau的磷酸化水平升高，PP2A活性下降。本研究结果显示：在AD脑内，酪氨酸307（Y307）位点的磷酸化可能是PP2A活性下调的重要原因，Aβ沉积，雌激素缺乏或锌离子沉积可能通过上调PP2A的酪氨酸（Y307）磷酸化使得PP2A活性下调，促进tau蛋白过度磷酸化，最终参与神经原纤维缠结的形成。
第一部分:蛋白磷酸酯酶2A的酪氨酸磷酸化在阿尔茨海默病神经元纤维缠结形成中的作用。
蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性下调在阿尔茨海默病(AD) tau蛋白异常过度磷酸化中起关键作用，然而PP2A活性下调的原因和机制还未阐明。有报道在体外实验中，PP2A催化亚单位（PP2Ac）酪氨酸307（Y307）位点的磷酸化可使PP2A活性显著下降。本研究中，采用特异性针对Y307位点磷酸化的PP2A的抗体，系统研究了AD脑内PP2A的酪氨酸磷酸化修饰及其与AD相关病变如淀粉样蛋白Aβ沉积和雌激素缺乏的关系。
(1) 免疫组化和激光共聚焦研究结果显示：酪氨酸307磷酸化的PP2A(PP2Ac-Yp307)在AD易感脑区如内嗅皮质、海马等异常聚集于已有神经原纤维缠结和即将发生神经原缠结的神经元，且Yp307磷酸化的PP2Ac与磷酸化的tau蛋白共定位，二者的磷酸化水平呈正相关。
(2)在稳定表达人类瑞典突变的淀粉样前体蛋白(APPswe)的小鼠成神经瘤细胞(N2a)中，tau发生过度磷酸化，同时，PP2Ac-Yp307的水平增高。
(3) 同样的改变也见于APPswe/ presenilin(PS1，A246E)转基因鼠脑中。
(4) 用Aβ25-35处理野生型N2a细胞，可模拟N2a APPswe细胞内tau和PP2Ac-Yp307的改变。
(5) 在雌激素受体α或β(Erα or Erβ)基因敲除的小鼠脑内，PP2Ac-Yp307和tau的磷酸化水平也同时升高。
本研究结果显示：在AD脑内，Aβ沉积或雌激素缺乏可能通过上调PP2A的酪氨酸（Y307）磷酸化使得PP2A活性下调，促进tau蛋白过度磷酸化，最终导致神经原纤维缠结的形成。
第二部分：硫酸锌通过下调蛋白磷酸酯酶2A的活性导致tau蛋白过度磷酸化。
金属离子锌在脑内的水平增高在阿尔茨海默病的神经退行性变特别是Aβ过度沉积中起重要作用，然而对于锌离子是否参与神经元纤维缠结的形成和tau蛋白的过度磷酸化，以及其内在的机制，目前还未完全阐明。
本研究中，用磷酸锌处理体外培养的N2a细胞和大鼠脑组织活片，用免疫印迹法检测tau蛋白的磷酸化水平，用酶活性测定法检测蛋白磷酸酯酶2A的活性。结果显示：锌处理可导致tau蛋白在AD脑内异常过度磷酸化位点Ser396/404（PHF-1位点），Ser198/199/202位点(tau-1位点)发生过度磷酸化，总tau的水平也增加。同时，蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）的活性下降，失活形式的PP2A（PP2Ap(Y307)）水平增加。
结论：锌可导致tau蛋白在PHF-1和tau-1位点发生过度磷酸化，此效应部分由PP2A失活所介导。
第三部分：阻断酪氨酸蛋白激酶Src表达对蛋白磷酸酯酶2A和tau蛋白磷酸化的影响。
目的：研究细胞内酪氨酸蛋白激酶Src对蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）酪氨酸307位点(Y307)磷酸化和活性以及tau蛋白磷酸化的影响，为AD脑内PP2A活性下调和Tau蛋白异常磷酸化的机制提供实验依据。
方法：体外培养小鼠成神经瘤N2a细胞，转染特异性阻断Src表达的SiRNA降低Src蛋白的水平，检测转染不同时间点PP2A Y307的磷酸化水平，PP2A的活性以及tau蛋白在不同位点的磷酸化水平。
结果：转染Src SiRNA12h可显著降低Src蛋白的水平，同时PP2A Y307的磷酸化水平下降，但总的PP2A蛋白水平也降低，伴随PP2A活性下调，tau蛋白在Ser198/199/202位点发生过度磷酸化。
结论：细胞内PP2A活性的调节受多种因素的参与，单纯阻断上游Src激酶的表达可降低PP2A的活性，并导致tau蛋白的过度磷酸化。