论文部分内容阅读
无义密码子介导的mRNA降解是真核生物体内一种重要的mRNA质量监督机制。该机制能够特异性的识别和选择性的降解含有提前终止密码子的mRNA,防止具有潜在危害作用的截断蛋白的产生,改变由提前终止密码子引起的某些疾病的症状和遗传方式。谷胱甘肽-S-转移酶由两个同源二聚体亚基组成,是生物体内一种重要的二相解毒酶,其中谷胱甘肽-S-转移酶mu亚基对猪胚胎的着床具有调控作用而影响母猪的繁殖性能。研究发现猪GSTM2基因发生无义突变形成含有提前终止密码子的mRNA,使得GSTM2基因的mRNA发生了NMD现象,缺失了GSTM2的功能可能会导致猪胚胎的死亡或出生后夭折。为研究NMD现象在猪胚胎生长发育过程中的作用,试验采用RNA干扰技术离体模拟GSTM2基因功能缺失,从而开展与之相关基因的转录组研究。研究结果如下：1.设计合成了三对GSTM2基因的siRNA序列,并利用脂质体LipofectamineTM2000将三对siRNA片段转染猪睾丸细胞和猪肾细胞。经荧光检测后,猪肾细胞与猪睾丸细胞相比较具有较高的转染率。2.利用实时定量PCR在mRNA水平上检测GSTM2基因的表达量,结果显示GSTM2基因的表达量在猪睾丸细胞和猪肾细胞中都出现了显著的下调(p<0.01)。猪肾细胞由于转染率较高,其基因抑制率也较高。3.利用实时定量PCR在干扰24h、48h、72h后分别检测GSTM2基因的表达量。结果显示在干扰24h后两种细胞内的GSTM2基因表达量达到最低。72h后猪睾丸细胞中GSTM2基因的表达量恢复至正常水平,而猪肾细胞中GSTM2基因的表达量没有恢复至正常水平。4.利用Western blot技术在蛋白水平上检测GSTM2基因的表达量,结果显示在RNA干扰48h后猪睾丸细胞和猪肾细胞中GSTM2的蛋白表达量在都出现了明显的下降。5.构建了低表达量的GSTM2基因的cDNA文库,筛选了243个显著差异表达基因和156个显著富集通路。