前列腺癌是我国常见的男性生殖系统肿瘤,且近年来发病率快速增长。前列腺癌具有高度异质性和激素敏感性。尽管人们尚未完全阐明前列腺癌的发生机制,研究者已普遍接受高级别上皮内瘤变(high-grade prostatic intraepithelial neoplasia,HGPIN)是前列腺癌癌前病变的观点。HGPIN→隐匿癌→临床癌→转移可能是大多数前列腺癌的进展模式。临床癌的进展顺序为局限于前列腺内→侵犯并突破前列腺包膜→侵犯精囊腺→转移至邻近区域淋巴结→转移至骨骼(最多见)和其他脏器。针对局限性前列腺癌(localized prostate cancer),临床上主要以手术治疗为主。雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy,ADT)是进展期前列腺癌(advanced prostate cancer)的主要治疗手段,但大多数患者经过1～3年的治疗后出现复发,逐渐发展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。随着新一代抗雄药物如阿比特龙或恩杂鲁胺的使用,一部分晚期前列腺癌患者易发生激素治疗诱发的神经内分泌前列腺癌(neuroendocrineprostate cancer,NEPC),多数患者在诊断后一到两年内死亡,其预后极差。前列腺癌肿瘤转移和激素抵抗依然是治疗过程中的重要挑战,是导致患者治疗失败和死亡的最主要原因。因此,有关前列腺癌恶性进展的机制,尤其是CRPC和NEPC相关分子机制亟需进一步阐明。SOX4(sex-determining region Y-box 4)基因是一种与发育和分化相关的转录因子,前期研究发现SOX4在多种肿瘤组织例如膀胱癌、肝癌、急性粒细胞白血病、前列腺癌、内皮细胞癌等中表达上调。本课题组和他人研究发现SOX4高表达与前列腺癌高Gleason评分、患者预后不良相关;SOX4高表达促进前列腺癌细胞增殖、迁移和浸润,且诱导前列腺癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT);本课题组前期研究发现,SOX4是雄激素抑制性基因。与雄激素敏感性前列腺癌相比,SOX4在CRPC中表达上调。以上提示SOX4可能参与前列腺癌的进展。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的微小RNA,它们一般通过碱基配对原则与messenger RNA(mRNA)部分结合,从而在转录后水平调节mRNA的表达与稳定。MiRNAs参与多项生理和病理过程,多种miRNAs在包括前列腺癌在内的多种肿瘤疾病中表达异常,miRNAs在前列腺癌中发挥促进或抑制的作用,本课题组前期研究识别了在前列腺癌进展中发挥重要作用的miRNAs,如miR-30a、miR-33b、miR-200b/c、miR-204、miR-573 和 miR-132/212 等。SOX4作为转录因子,在前列腺癌中转录调节多种靶基因表达,如EZH2、EGFR、HSP70、CUL4B、Tenascin C 等,但在前列腺癌中有关 SOX4对miRNAs的调控尚无报道。因此,我们提出科学问题:在前列腺癌中,SOX4作为一个转录因子是否可以调节miRNAs及其靶基因的表达;同时进一步阐明SOX4促进前列腺癌进展的下游靶分子及其作用机制。本研究采用前列腺癌细胞系,在动物、细胞、分子水平行进功能和分子机制的研究,并取得以下结果:第一部分SOX4/m iR-17-92/RB1轴促进前列腺癌进展的研究我们与他人前期体外实验证实,SOX4高表达可以促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭;SOX4可以通过促进EMT来促进前列腺癌进展。MiRNAs参与前列腺癌的发生发展,我们提出科学问题:SOX4作为一个转录因子是否可以调节miRNAs的表达;以及被调节的miRNAs的下游靶基因是什么。同时进一步阐明SOX4促进前列腺癌进展的下游靶分子及其作用机制。本研究以前列腺癌细胞系为研究对象,在动物、细胞、分子层面行进功能和分子机制的研究,并取得了以下结果:1.SOX4低表达抑制前列腺癌肿瘤体内生长和转移为了研究SOX4在体内环境中对前列腺癌细胞的作用,我们进行裸鼠皮下成瘤实验。结果显示,对照组(VCaP-shNC)形成皮下移植瘤并快速生长,然而直至实验结束SOX4低表达组(VCaP-shSOX4)仍没有皮下瘤生成。另外,对照组(VCaP-shNC)裸鼠中有3只出现肺脏转移,而SOX4低表达组(VCaP-shSOX4)裸鼠没有出现肺转移。以上结果证明,SOX4低表达可以显著抑制前列腺癌移植瘤形成和转移。2.SOX4下游miRNAs生物信息学分析首先,我们在VCaP细胞中瞬时沉默SOX4表达后,进行miRNAs-seq数据分析,结果发现,与对照组(VCaP-NC)相比,以>2.0倍变化为标准,在VCaP-siSOX4组中共有92个miRNAs表达上调,154个miRNAs表达下调。其中表达变化倍数最大的 miRNAs 如 miR-30a-5p、miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-20a-5p、miR-93-5p等。其次,利用The Cancer Genome Atlas(TCGA)前列腺癌患者信息数据,Pearson法分析与SOX4表达具备正/负相关性的miRNAs,结果显示,在前列腺癌患者中,miR-20a、miR-19a、miR-200b、miR-183等的表达与 SOX4 表达具有相关性。最后,分析GSE55829数据集(CRPC移植瘤及其对照移植瘤miRNAs-seq数据集)结果发现,与对照组相比,miR-19a、miR-20a、miR-26b、miR-30b等在CRPC移植瘤中表达上调。值得关注的是,miR-19a和miR-20a同时满足上述三个分析条件,且这两个miRNAs 同时属于 miR-17-92 簇(成员包括:miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-20a-5p、miR-92a-3p)。以上结果提示,miR-17-92 簇可能是 SOX4的靶 miRNAs。3.SOX4通过结合到miR-17-92簇启动子区域来促进其表达RT-qPCR检测发现SOX4可以促进前列腺癌细胞中miR-17-92簇成员的表达。鉴于SOX4作为转录因子,我们提出假设:SOX4可能在转录水平调节miR-17-92的表达。首先我们验证SOX4可以促进pri-miR-17-92和pre-miR-17-92的表达。其次,染色质免疫共沉(ChIP)实验发现,在前列腺癌细胞中,SOX4蛋白可以与miR-17-92启动子313-322位置结合。另外,双荧光素酶报告实验显示,SOX4低表达可以降低前列腺癌细胞野生型miR-17-92启动子荧光素酶活性,而对突变313-322位置的启动子荧光素酶活性无明显影响。以上结果证实:在前列腺癌细胞中,SOX4可以转录上调miR-17-92簇的表达。4.SOX4通过miR17-92簇影响前列腺癌细胞的增殖、迁移和浸润EDU实验和Transwell实验结果显示:与对照组相比,单独沉默SOX4表达可以抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和浸润,但同时共转染miR-17-92簇各个成员mimics可以部分逆转SOX4低表达所致的前列腺癌细胞增殖、迁移和浸润能力降低;与对照组相比,单独过表达SOX4可以促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和浸润,同时共转染miR-17-92簇各个成员inhibitors可以部分逆转SOX4过表达所致的前列腺癌细胞增殖、迁移和浸润能力增强。以上结果显示,miR-17-92簇介导SOX4诱导的前列腺癌细胞增殖、迁移和浸润。5.RB1是SOX4/miR-17-92簇的下游作用分子在LNCaP细胞中沉默和过表达SOX4,并进行全基因组表达谱芯片(GSE11914)分析,Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)分析 GSE11914 数据,筛选SOX4潜在靶基因;同时,阅读文献和生物信息学分析miR-17-92簇的靶基因。分析结果筛选出RB1基因可能是SOX4/miR-17-92簇的下游靶基因。Western Blot和RT-qPCR实验发现:在前列腺癌细胞中,SOX4抑制RB1蛋白表达但对RB1-mRNA水平无明显影响,提示SOX4可能在转录后水平调节RB1蛋白的表达,miR-17-92簇可能参与这一调节过程。随后,Western Blot和双荧光素酶报告实验证实:在前列腺癌细胞中,RB1是miR-17-5p和miR-20a-5p的靶基因。另外,拯救实验证明,miR-17-5p和miR-20a-5p mimics部分逆转SOX4低表达所致的RB1蛋白增高;miR-17-5p和miR-20a-5p inhibitors部分逆转SOX4过表达所致的RB1蛋白降低。结果证实,RB1是SOX4/miR-17-92轴的靶基因,SOX4通过转录上调miR-17-92簇表达而抑制RB1蛋白表达。6.SOX4、miR-17-92 和 RB1 体内共表达公共数据库GSE26367分析发现:在前列腺癌患者中,miR-17-92簇成员的表达水平与SOX4的表达呈明显正相关。另外,在本课题搜集的前列腺癌患者组织中,miR-17-5p和miR-19a-3p在SOX4高表达组患者中的表达明显高于SOX4低表组达患者。公共数据库GSE35988分析发现:在前列腺癌患者中,RB1的表达水平与SOX4的表达呈显著负相关(R=-0.7882,P<0.0001)。IHC法检测前列腺癌患者组织中SOX4和RB1表达状态,结果显示23%(32/140)病人患者中呈现SOX4高表达状态,约7%的病人患者呈现RB1蛋白缺失状态。其中有7例前列腺小细胞癌病例,IHC结果显示,71%(5/7)的SOX4过度表达,57.1%(4/7)的RB1丢失。值得注意的是,IHC显示前列腺癌患者RB1蛋白表达与SOX4表达呈负相关。总之,我们的数据表明,SOX4、miR-17-92簇和RB1的共同表达之间存在显著的关系,这提示SOX4/miR-17-92/RB1轴可能存在,并促进前列腺癌的进展。7.SOX4高表达与前列腺癌进展和神经内分泌样表型相关现有研究发现RB1基因缺失是NEPC的特征之一,RB1功能缺失促进前列腺癌和CRPC的进展。因此,我们提出假设:SOX4/miR-17-92/RB1轴可能参与前列腺癌神经内分泌样表型。我们利用生物信息学数据库,结合Gene Expression Omnibus(GEO)datasets及cbioportal数据库,分析SOX4在正常前列腺组织、前列腺癌、CRPC、NEPC中的表达水平,我们发现SOX4表达水平随着前列腺癌进展而逐步增高,且SOX4高表达与神经内分泌样表型相关。8.SOX4低表达抑制前列腺癌细胞神经内分泌样改变与增殖根据前期研究报道建立具有神经内分泌样表型改变的LNCaP-NE细胞。稳定沉默SOX4后,部分具有神经内分泌样表型的LNCaP-NE细胞转化为圆形的上皮样细胞;另外,稳定沉默SOX4抑制LNCaP-NE细胞增殖和神经内分泌前列腺癌标记物(NCAM1、CHGA、CHGB、SYP)的表达。综上所述,SOX4低表达抑制前列腺癌肿瘤形成和肺转移;SOX4通过转录上调miR-17-92簇表达从而抑制RB1蛋白表达。在前列腺癌患者中,miR-17-92簇成员表达与SOX4表达呈正相关,而RB1表达与SOX4表达呈负相关。SOX4表达水平随着前列腺癌进展而逐渐增高,SOX4低表达抑制前列腺癌细胞的神经内分泌样表型。以上结果提示,可能存在SOX4/miR-17-92/RB1轴促进前列腺癌的进展。第二部分SOX4通过调节m i R-224-452簇及其靶基因BMI1促进去势抵抗性前列腺癌进展的研究本课题组前期工作研究发现:SOX4是雄激素抑制性基因;与雄激素敏感性前列腺癌组织相比,SOX4在CRPC中表达上调。但是,SOX4在CRPC中的作用及其机制尚未阐明。因此,本研究通过对公共数据库和全基因组表达谱芯片分析,采用CRPC细胞系进行和多项分子生物化学实验,在多层面进行SOX4生物学作用及其分子机制的研究,取得了以下结果:1.SOX4高表达与CRPC预后不良相关为进一步明确SOX4和CRPC的关系,我们利用生物信息学数据库,结合GEO datasets及cbioportal数据库,分析SOX4在局限性前列腺癌和CRPC中的表达水平,并进行GSEA生物信息分析。同时,IHC法检测前列腺癌(包括局限性前列腺癌和CRPC)组织芯片中SOX4的表达。结果显示,与局限性前列腺癌相比,SOX4在CRPC中表达明显上调;且沉默SOX4表达后下调的基因集富集在转移性CRPC患者组和移植瘤组。以上结果提示SOX4高表达可能参与CRPC进展。2.SOX4低表达抑制CRPC细胞增殖和迁移EDU和细胞克隆实验结果证明,SOX4低表达可以抑制CRPC细胞增殖;且与常规培养细胞状态下相比,在雄激素剥夺培养状态下,SOX4低表达抑制CRPC细胞增殖的作用更为明显。此外,CRPC裸鼠皮下成瘤实验证实,与对照组(C4-2B-shNC)相比,SOX4低表达组(C4-2B-shSOX4)肿瘤平均体积和重量更小、Ki67细胞阳性率更低。Transwell实验证明,SOX4低表达可以抑制CRPC细胞迁移和浸润;且与常规细胞培养状态下相比,在雄激素剥夺培养状态下,SOX4低表达发挥更强的抑制CRPC细胞迁移和浸润的作用。此外,CRPC裸鼠皮下成瘤实验证实,SOX4低表达可减少肿瘤细胞肌层浸润和肺脏转移。以上结果显示,在体内外环境中,SOX4低表达抑制CRPC细胞增殖和转移。3.SOX4下游基因和miRNAs生物信息学分析采用C4-2B细胞进行瞬时沉默SOX4表达后,进行全基因组表达谱芯片分析,GSEA分析结果提示,SOX4与Wnt信号通路、SHH信号通路、ESC信号通路,PRC2-EZH2、PRC1-BMI1、HOXA9、MYC 及 RB1 蛋白等具有相关性。利用前列腺癌公共数据库TCGA和GSE26367数据集,分析与SOX4表达呈负相关的 miRNAs,结果筛选出 miR-221、miR-222、miR-224、miR-31 和 miR-205等。值得关注的是,其中BMI1是miR-221、miR-222和miR-224的靶基因,且参与ESC信号通路。4.SOX4诱导BMI1蛋白表达Western Blot和细胞免疫荧光实验结果显示,在CRPC细胞中,SOX4低表达抑制BMI1蛋白的表达,而SOX4过表达促进BMI1蛋白表达。RT-qPCR结果显示,SOX4对BMI1-mRNA无明显调节作用。另外,在CRPC患者和移植瘤中,BMI1表达与SOX4表达呈正相关。拯救实验证实,单独干扰或过表达SOX4所引起的CPRC细胞增殖和迁移变化被可被BMI1过表达或干扰部分逆转。以上结果证实,BMI1是SOX4的下游靶基因,且介导SOX4促进CRPC细胞增殖和迁移作用。5.SOX4 抑制 miR-224-452 簇表达上述研究结果提示,SOX4对BMI1蛋白的调节可能发生在转录后水平,miRNAs可能参与这一过程。通过对前列腺癌公共数据库和miRNA靶基因预测等分析,我们筛选出miR-224-452簇可能受SOX4的调节,且可能参与SOX4对BMI1调节过程。RT-qPCR结果显示,在CRPC细胞中,SOX4抑制miR-224-452簇的表达,且EZH2介导SOX4对miR-224-452簇的调节过程。Western Blot实验结果显示,SOX4下调EZH2蛋白表达,CoIP实验证实SOX4蛋白与EZH2蛋白结合。ChIP实验结果显示,miR-22-452簇宿主基因GABRE启动子区域有EZH2蛋白结合,H3K27m3甲基化明显。另外拯救实验结果显示,miR-224-452 inhibitors介导SOX4促进CRPC细胞迁移的作用。以上结果显示,在CRPC细胞中,miR-224-452簇是SOX4下游靶miRNAs。6.SOX4抑制miR-224-452簇表达而上调BMI1蛋白表达Western Blot 实验结果显示,在 CRPC 细胞中,miR-224-5p 和 miR-452-5p mimics 抑制 BMI1 蛋白表达,而 miR-224-5p 和 miR-452-5p inhibitors 促进 BMI1蛋白的表达。双荧光素酶报告实验结果显示,miR-224-5p和miR-452-5p mimics抑制野生型BMI1-3’UTR荧光活性,miR-224-5p和miR-452-5p inhibitors促进野生型BMI1-3’UTR荧光活性,但对突变型BMI1-3’UTR荧光活性无明显影响。另外,拯救实验证明,miR-224-452簇可以部分逆转SOX4高表达所致的BMI1蛋白增高;miR-224-452 inhibitors部分逆转SOX4低表达所致的BMI1蛋白降低。7.SOX4通过BMI1促进CRPC干细胞表型越来越多的研究证实干细胞样改变促进肿瘤的发生、进展和转移。前期研究发现BMI1通过调节前列腺癌细胞干性以促进前列腺癌进展;另外,SOX4介导细胞发育和分化等。我们设想SOX4促进CRPC干细胞样改变,且BMI1可能介导这一过程。首先,GSEA分析结果显示,干细胞相关基因集富集在CRPC患者组、SOX4高表达组。另外,分析CRPC病人公共数据集发现,肿瘤干细胞标志物(BMI1、SOX2、CD44、CD133)表达与SOX4表达呈正相关。微球形成实验显示,SOX4过表达增加C4-2B细胞微球形成能力,而同时干扰BMI1后降低SOX4过表达所致的微球形成能力增高。同时,RT-qPCR和Western Blot结果显示,SOX4过表达显着上调肿瘤干细胞标志物(CD44,CD133,NKX3.1和NANOG)的表达,同时沉默BMI1降低了这些肿瘤干细胞标志物表达水平。综上所述,SOX4在CRPC中表达增高,SOX4低表达在雄激素剥夺状态下发挥更强的抑制CPRC细胞增殖和转移的作用。SOX4通过抑制miR-224-452簇表达而上调BMI1蛋白表达,促进CRPC细胞的干细胞样表型,进而促进CRPC的恶性进展。本课题首次系统研究了前列腺癌中SOX4可能调控的miRNAs,并验证SOX4调控miRNAs及其靶基因的表达,拓展了 SOX4促进前列腺癌进展的机制。