目的：　　 缓慢型心律失常是临床上常见的心律失常类型，严重影响患者的生活质量和生命安全。20世纪50年代，心脏植入性电子起搏装置的发明，为该病的治疗带来了革命性的变化。然而，心脏电子起搏器终究只是一种缓解症状的治疗方法，在长期的使用过程中也出现了诸多缺陷。心脏起搏生理的基础研究方面的进展，为起搏功能障碍的治疗开辟了新的前景，生物起搏器的概念也应运而生。近十余年以来，生物起搏器的研究取得了巨大进展。目前，生物起搏器的体内实验主要通过外科开胸手术的途径进行移植，存在创伤大、定位效果差等缺点，因此移植途径是制约生物起搏器临床应用的重要因素之一。探索适宜的移植手段是促进生物起搏进入临床实验阶段所需要克服的重要问题。本课题以犬的骨髓间充质干细胞(Bone-Marrow Mesenchymal Stem Cells，BM-MSCs)作为基因转染的靶细胞，构建超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated channels 2，HCN2)基因的重组慢病毒载体，转染BM-MSCs，研究和验证转染后BM-MSCs在体外的起搏功能。采用自行研究设计的经皮心肌内注射导管，通过介入方法将体外构建的生物起搏器移植到实验动物犬的体内，探索该方法的安全性和可行性。　　 方法：　　 采用密度梯度离心法分离犬的BM-MSCs并进行培养。扩增目的基因mHCN2，构建重组慢病毒表达载体。重组质粒和慢病毒包装系统共同转染T293细胞进行慢病毒的包装。Real-timePCR法检测病毒滴度。Lenti-GFP-HCN2以不同感染复数(multiplication of infection，MOI)转染第3-4代BM-MSCs，确定最佳MOI。设置Lenti-GFP-HCN2转染的BM-MSCs为实验组，Lenti-GFP转染的BM-MSCs为阴性对照组，未转染的BM-MSCs为空白对照组。全细胞膜片钳检测各组BM-MSCs的起搏电流。分离培养新生乳鼠心肌细胞(neonatal rats cardiomyocytes，NRCs)，将各组BM-MSCs和NRCs进行共培养，观察细胞搏动情况，并记录收缩频率。　　 经颈动脉和股静脉途径分别进入犬的左、右心室，进行龙胆紫稀释液的多点注射，检验自行研究设计的经皮心肌内注射导管的操作性能。将16只健康成年杂种犬(20-25kg)随机分为实验组（注射0.6ml转染了Lenti-GFP-HCN2的MSCs，n=8），阴性对照组（注射0.6ml转染了Lenti-GFP的MSCs，n=4）和空白对照组（注射0.6ml生理盐水，n=4）。经颈动脉途径放入自行设计的注射导管，在左心室室间隔位置定点注射。术后埋植体外遥测的心电记录仪实时监测犬的心率和心律。移植术后2周，对实验动物犬进行双侧迷走神经刺激（S1S1周长100ms/60ms，电压3-5V，时程1min，间隔10min）。记录逸搏心率的频率，分析逸搏来源以及迷走神经刺激后出现逸搏心率的时间间隔。术后2周达实验终点，留取心脏组织标本，冰冻切片后一部分直接在荧光显微镜下观察荧光，一部分进行HE染色以及Cx43，GFP和CD68的免疫荧光染色。　　 结果：　　 基因测序表明目的基因HCN2已经成功重组至慢病毒表达载体，重组质粒转染T293细胞后，western blot证实在蛋白水平上有HCN2的过表达。本实验中确定慢病毒感染犬BM-MSCs的最佳MOI为20，在转染后48h开始表达绿色荧光,5天达高峰。实验组BM-MSCs可记录到超极化激活的内向电流，而阴性对照组和空白组BM-MSCs在相同记录条件下未能检测到明显的超极化内向电流。实验组BM-MSCs有HCN2蛋白过表达，而阴性对照组和空白组BM-MSCs未见表达。BM-MSCs和NRCs共培养后第3天，实验组NRCs的细胞收缩频率较阴性对照和空白对照组显著提高（P＜0.05）。　　 经皮心肌内注射导管注射的有效性为91.6％，未出现严重并发症。移植术后各组的体外遥测心电记录仪显示室性早搏和室性心动过速的发生在各组间未见显著差异。双侧迷走神经刺激结果发现实验组的异搏心率主要来自注射腔左心室，频率为50.8±3.2bpm，而阴性对照组和空白组的异搏心率主要来自右心室，频率为42.2±6.1bpm(P＜0.05)。免疫荧光检测显示介入方法移植到左心室的BM-MSCs在术后2周仍有存活，细胞之间有Cx43的表达和连接，HE染色和CD68的免疫荧光染色显示移植部位并没有显著炎症形成。　　 结论：　　 mHCN2重组慢病毒(Lenti-GFP-HCN2)转染犬的BM-MSCs能在体外发挥起搏功能。自行研究设计的经皮心肌内注射导管可以用于在体移植转染的BM-MSCs，构建生物起搏器，该方法具有良好的有效性和安全性。利用该导管移植Lenti-GFP-HCN2转染的犬BM-MSCs可以在体内存活，并在移植部位重建起搏点，形成异位搏动。