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1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, SIP)是一种存在于血浆中的多效信号脂质分子。它既可在细胞内作为第二信使传递信号,同时,它亦可作为第一信使与细胞膜上相应的G蛋白偶联受体相互作用参与包括细胞迁移、存活、增殖、血管生成、免疫以及过敏反应等生物学作用。现已发现与S1P特异性结合的G蛋白偶联受体共有5种,分别为S1P1R、S1P2R、S1P3R、S1P4R和S1P5R(亦称S1P1、S1P2、S1P3、S1P4和S1P5)。由于其基因序列与内皮细胞相似,曾有一段时间被称为内皮细胞分化因子(EDG1、EDG5、EDG3、EDG6和EDG8)。经过多年的研究,普遍认同细胞种类的不同,S1P受体的表达情况也有很大的差异。大量研究证明内皮细胞中只存在S1P1R、S1P3R和无／少量S1P2R,这三种受体的表达及激活状态的动态平衡维持正常内皮细胞的功能。在内皮细胞的一个重要功能——内皮屏障功能中,S1P1R的激活能降低内皮细胞通透性,从而增加内皮屏障功能；S1P2R和S1P3R则相反,其激活能增加内皮细胞通透性,从而降低内皮屏障功能。在S1P受体生理学功能已研究较透彻的同时,病理情况下对S1P受体表达及其功能影响的研究尚少。LPS及TNF-α作为致炎物质能破坏内皮细胞间连接,从而导致内皮细胞通透性的增高。本研究选取ECV 304和HMVEC细胞,采用RT-PCR和Western blot方法,在明确ECV 304和HMVEC细胞S1P受体表达特性的基础上,探讨LPS或TNF-α刺激对这两种细胞S1P受体表达的影响；并通过双层小室检测内皮细胞单层荧光标记物的漏出率,用通透系数Pa的大小反应内皮细胞单层的通透性,观察其受体表达和活性的变化对LPS或TNF-α所致的内皮细胞高通透性中的作用。一、S1P受体在ECV 304和HMVEC中的特点已有不少文献报道,内皮细胞表达的S1P受体主要是S1P1R、S1P2R和S1P3R。本实验证明了ECV 304及HMVEC细胞中均有S1P1R、S1P2R和S1P3RmRNA的表达。但在蛋白水平上,ECV 304细胞中仅可见S1P2R的蛋白条带,而在HMVEC中,可见SIPIR、S1P2R和S1P3R的蛋白条带。结果显示：在ECV304细胞中较多表达S1P2R,而不表达S1P1R和S1P3R。在HMVEC中,S1P1R的表达较多,S1P3R的表达次之,而S1P2R表达较少。结果提示,虽然在mRNA水平上ECV 304和HMVEC的S1P受体表达没有差别,但蛋白表达显示明显的特点。本结果进一步证明,不同来源的内皮细胞S1P受体的表达各有差异,体现了内皮细胞的异质性；研究还首次查明了ECV 304和HMVEC中S1P受体表达的特点。二、LPS刺激后ECV 304和HMVEC细胞S1P受体表达的改变及其对通透性的影响1.LPS刺激后ECV 304和HMVEC细胞S1P1R和S1P3R表达的改变(1)LPS刺激后ECV 304细胞S1P1R和S1P3R表达的改变LPS刺激后, ECV 304细胞S1P1R和S1P3R的mRNA表达变化无统计学差异(P>0.05),亦未见明显的蛋白表达。(2)LPS刺激后HMVEC细胞S1P1R和S1P3R表达的改变LPS刺激后,HMVEC的S1P1R和S1P3R的mRNA表达变化无统计学差异(P>0.05),蛋白表达亦未见明显变化。2.LPS刺激后ECV 304和HMVEC细胞S1P2R表达的改变(1)LPS刺激后ECV 304细胞S1P2R表达的改变结果表明,LPS刺激可以分别以剂量和时间依赖的关系使ECV 304细胞S1P2R mRNA的表达较正常对照组显著增加(P<0.05)；蛋白表达结果也显示,在ECV 304细胞中,LPS以剂量和时间依赖的方式使S1P2R蛋白的表达较正常对照组显著增高(P<0.01)。结果提示,LPS刺激ECV 304细胞可使其S1P2R的mRNA和蛋白表达水平均显著增加。(2)LPS刺激后HMVEC细胞S1P2R表达的改变结果表明,LPS刺激可以分别以剂量和时间依赖的关系使HMVEC细胞S1P2R mRNA的表达较正常对照组显著增加(P<0.05)；蛋白表达结果也显示,在HMVEC细胞中,LPS以剂量和时间依赖的方式使S1P2R蛋白的表达较正常对照组显著增高(P<0.05)。结果提示,LPS刺激HMVEC细胞可使其S1P2R的mRNA和蛋白表达水平均显著增加。3.抑制S1P2R的活性对LPS介导的ECV 304和HMVEC内皮细胞高通透性的影响(1)抑制S1P2R的活性对LPS介导的ECV 304内皮细胞高通透性的影响在ECV 304细胞中,0.2nmol/ml JTE-013使Pa值从单纯LPS刺激的192%下降到134%(P=0.000)。结果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低LPS介导的内皮细胞高通透性。(2)抑制S1P2R的活性对LPS介导的HMVEC中内皮细胞高通透性的影响在HMVEC中,JTE-013 0.2nmol/ml使Pa值从单纯LPS刺激的206%下降到156%(P=0.010)。结果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低LPS介导的内皮细胞高通透性。三、TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC细胞S1P受体表达的改变及其对通透性的影响1.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC细胞中S1P1R表达的改变(1)TNF-α刺激后ECV 304细胞中S1P1R表达的改变结果表明,TNF-α刺激可以分别以剂量和时间依赖的关系使ECV 304细胞S1P1R mRNA的表达较正常对照组显著增加(P<0.01)。结果提示,TNF-α刺激ECV 304细胞可使其S1P1R的mRNA表达水平显著增加。(2)TNF-α刺激后HMVEC细胞中S1P1R表达的改变在HMVEC细胞中,100ng/ml的TNF-α刺激24 h后使S1P1R的表达较正常对照组显著增加(P<0.01),且刺激12 h和24 h后的变化也有显著差异。之间有显著差别(P<0.05)。结果提示,TNF-α刺激HMVEC细胞可时间依赖地导致S1P1R的mRNA表达水平增加。2.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC细胞中S1P2R表达的改变(1)TNF-α刺激后ECV 304细胞中S1P2R表达的改变TNF-α刺激可以分别以剂量和时间依赖的关系使ECV 304细胞S1P2RmRNA的表达较正常对照组显著增加(P<0.01);蛋白表达结果也显示,在ECV304细胞中,TNF-α以剂量和时间依赖的方式使S1P2R蛋白的表达较正常对照组显著增高(P<0.05)。结果提示,TNF-α刺激ECV 304细胞可使其S1P2R的mRNA和蛋白表达水平均显著增加。(2)TNF-α刺激后HMVEC细胞中S1P2R表达的改变＼结果表明,TNF-α刺激可以剂量依赖的关系使HMVEC细胞S1P2RmRNA的表达较正常对照组显著增加(P<0.05)；但在时间效应中,TNF-α刺激12 h后S1P2RmRNA表达出现明显的下调现象(P<0.01),在24 h后S1P2RmRNA表达则显著增加(P<0.01)。蛋白表达结果也显示,在HMVEC细胞中,TNF-α以剂量依赖的方式使S1P2R蛋白的表达较正常对照组显著增高(P<0.05)；而在时间效应中,S1P2R蛋白表达在刺激24 h后出现显著增加(P<0.05)。结果提示,TNF-α刺激HMVEC细胞可使其S1P2R的mRNA和蛋白表达水平均显著增加。3.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC细胞中S1P3R表达的变化(1)TNF-α刺激后ECV 304细胞中S1P3R表达的变化TNF-α刺激后,ECV 304的S1P3R的mRNA表达变化无统计学差异(P>0.05)。(2)TNF-α刺激后HMVEC细胞中S1P3R表达的变化TNF-α刺激后,HMVEC的S1P3R的mRNA表达变化无统计学差异(P>0.05)。4.抑制S1P2R的活性对TNF-α介导的ECV 304和HMVEC内皮细胞高通透性的影响(1)抑制S1P2R的活性对TNF-α介导ECV 304内皮细胞高血管通透性的作用在ECV 304细胞中,0.2nmol/ml JTE-013使Pa值从单纯TNF-α刺激的208%下降到156%(P=0.000)。结果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低TNF-α介导的内皮细胞高通透性。(2)抑制S1P2R的活性对TNF-α介导HMVEC内皮细胞高血管通透性的作用在HMVEC细胞中,0.2nmol/ml JTE-013使Pa值从单纯TNF-α刺激的209%下降到153%(P=0.000)。结果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低TNF-α介导的内皮细胞高通透性。结论：1.静息ECV 304细胞表达S1P1R、S1P2R和S1P3RmRNA、S1P2R蛋白。而静息HMVEC表达S1P1R、S1P2R和S1P3RmRNA和蛋白。2.LPS刺激后ECV 304和HMVEC细胞S1P1R和S1P3R的mRNA及蛋白表达均无明显变化,S1P2R的mRNA和蛋白表达水平显著增高。结果提示S1P2R的表达增加可能参与介导LPS刺激对内皮细胞的损伤。3.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC中的S1P2R和蛋白表达显著提高；TNF-α刺激也引起ECV 304和HMVEC细胞S1P1R mRNA的表达增高；而S1P3R的mRNA表达无明显改变。结果提示S1P2R的表达增加可能参与介导TNF-α刺激对内皮细胞的损伤。4.抑制S1P2R的活性可降低LPS和TNF-α介导的单层细胞通透性增高,提示S1P2R的功能变化可能是LPS和TNF-α介导单层细胞通透性增高的途径之一。