缺铁性贫血(Iron DeficiencyAnemia,IDA)是指由各种原因导致机体缺铁而引起的小细胞低色素性贫血及相关的缺铁异常，是红色素合成异常性贫血中的一种。缺铁性贫血在世界范围内发生率很高，严重地影响患者的体能、工作效率,以及儿童的体力及智力发育，是我国和其它发展中国家所面临的主要公共卫生问题。治疗IDA最有效的方法是补充铁剂。由于简单方便易操作，膳食铁补充和口服铁剂补充在预防和治疗IDA中被广泛应用。口服铁剂是治疗缺铁性贫血的首选药物，但是目前用口服铁剂治疗或预防缺铁性贫血在用药剂量、补充时间和停药时间等方面仍然存在很多争议。临床口服铁剂的具体用药范围比较宽泛。美国药物研究所推荐的食物和补铁剂中总铁的摄入量上限（铁摄入量上限是指普通人群中不会引起不良反应的每天最大口服摄入量）为：0-13岁的儿童40mg/d，≥14岁的人45mg/d。国内常用口服铁剂硫酸亚铁0.3克/片（每片含铁60mg）的补充量为1-3次/日，即每日的补充范围从60mg到180mg铁。临床常见的补充方式有每日补充和间隔补充等多种,间隔时间也有每周补充1次或3天补充1次等多种。另外，大多数学者认为治疗缺铁性贫血在Hb恢复至正常之后还需要持续服药以恢复机体储存铁，防止贫血的复发。但不同医生制订的服药时间长短不一。有学者建议铁剂治疗应在血红蛋白恢复正常后至少持续4-6个月，另有学者建议至少补充一年。临床上患者服药时间的长短大多是根据医生经验决定。由于大量研究已经证实过量铁在体内沉积会导致组织细胞的氧化损伤。治疗IDA口服铁剂剂量范围宽泛，治疗时间较长，是否会引起机体铁过负荷及氧化应激已经引起人们的关注。在我们的预实验中发现，缺铁性贫血大鼠给予不同剂量的铁补充2周后，高剂量补铁组和低剂量组间大鼠血红蛋白均恢复至对照组的正常水平，两组间无统计学差别。那么用高剂量和低剂量补铁治疗缺铁性贫血的效果到底有没有区别？高剂量长时间铁补充是否会引起机体的铁过负荷？治疗IDA的合理补铁剂量应该是多少？阐明上述问题无疑可以为临床制订缺铁性贫血的合理治疗方案提供重要的实验依据。一、研究目的利用动物实验，对IDA大鼠给予不同剂量和不同时间的铁补充，观察其对于红细胞参数、铁营养状况和机体氧化应激/抗氧化能力的影响，为临床上预防治疗IDA并防止其他副作用的产生提供实验依据。二、方法（一）低铁饲料的配制：采用公职分析化学工作者协会(AOAC)推荐的低铁饲料配方配制动物饲料：玉米淀粉54%，奶粉40%，豆油5%，食盐1%。低铁饲料经原子吸收分光光度法测定铁含量，为15mg/kg。（二）缺铁性贫血大鼠模型制作选体重（140±10）g雄性SD大鼠（购自上海西普尔-必凯公司)，乙醚麻醉，用心脏放血法抽血，放血量为总血量的40%。放血量不足的大鼠，用眼眶采血法补足。通过短时间内大量向体外放血，造成急性失血性贫血。1ml全血约含铁0.5mg，因此，失血造成的贫血模型被公认为缺铁性贫血模型[20]。（三）不同剂量和不同时间铁补充对缺铁性贫血大鼠红细胞参数的影响1、补铁剂量的设定按照膳食铁含量为120mg/kg为正常含铁饲料计算（参考文献），健康青年SD大鼠每日摄入饲料约为20g，因此大鼠每日摄入铁量约为2.4mg。本实验中大鼠全部喂食上述配方低铁饲料（含铁量15mg/kg），在此基础上，铁补充剂量的设定是：低剂量为2.4mg/(100g·bw)、中剂量为4.8mg/(100g·bw)、高剂量为9.6mg/(100g·bw)。2、动物及分组112只雄性SD大鼠，体重（140±10）g，（购自上海西普尔-必凯公司）。适应性喂养3天，期间喂养正常含铁量饲料。随机分为不放血正常对照组（NC）和放血组。在放血后第3天，从空白对照组和放血组中各随机抽取8只大鼠处死，取血液和组织标本，观察模型是否符合缺铁性贫血的诊断标准（Hb<120g/L），确定放血组大鼠Hb为90（g/L）后，将放血组大鼠随机分为4个亚组，分别为单纯失血组（LC），低剂量铁补充组（NI），中剂量铁补充组（MI），高剂量铁补充组(HI)。空白对照组和各实验组大鼠再随机分为2周组和4周组。动物饲养在清洁级动物房，12h/12h自然昼夜节律变化光照。相对湿度为40%-60%，环境温度为24℃±1℃，自由饮食及去离子水，食物全部为低铁饲料（含铁量15mg/kg）。3、实验大鼠的补铁方法在自由进食缺铁饲料（含铁量15mg/kg）的基础上，NC组灌胃补铁2.4mg/(100g·bw)；LC组灌胃生理盐水1ml/(100g·bw)；NI组灌胃补铁2.4mg/(100g·bw)；MI组灌胃补铁4.8mg/(100g·bw)；HI组灌胃补铁9.6mg/(100g·bw)。每天1次，连续14天或28天。4、大鼠体重测定分别在实验第1天，第5天，第9天，第13天，第17天，第21天，第25天，第28天用天平检测体重值。5、大鼠红细胞参数的检测按照计划，分别在实验开始前和两周补铁、四周补铁结束时，测量各组大鼠的Hb，RBC，MCHC等参数。（四）不同剂量和不同时间铁补充对缺铁性贫血大鼠铁代谢的影响1、不同剂量铁补充对缺铁性贫血大鼠血清铁相关指标的影响两周组大鼠实验处理结束后，立即麻醉各组大鼠，心脏采血，心脏灌流取肝脏。血液离心后，取血清。血清经过相应的消化处理后，利用原子吸收分光光度计法测定各组大鼠血清铁含量。利用Elisa试剂盒测定大鼠血清铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体水平。四周组方法同两周组。2、不同剂量铁补充对缺铁性贫血大鼠肝铁含量的影响肝组织经过消化处理后，测定各组大鼠肝脏铁含量。3、不同剂量铁补充对缺铁性贫血大鼠铁吸收率的影响NC组、NI组、MI组、HI组每组随机选取4只大鼠用于代谢实验。分别于大鼠代谢实验的前一天从清洁级动物房中移至不锈钢代谢笼（购自上海科科医学模型有限公司）中单笼饲养。期间自由进食去离子水和低铁饲料（含铁量为15mg/kg），于实验第1天，第5天，第9天，第13天，第17天，第21天，第25天，第28天测量进食量及收集粪便。粪便干燥后消化处理，用原子吸收分光光度计法测定粪便铁含量。计算铁表观吸收率=（食物中铁含量-粪便中铁含量/食物中铁含量）×100%。4、不同剂量不同时间铁补充对肝细胞铁代谢相关蛋白表达的影响用Western-blotting的方法，检测肝组织铁蛋白、肝脏hepcidin和TfR-1表达水平的影响。（五）不同剂量和不同时间铁补充对缺铁性贫血大鼠氧化应激/抗氧化能力的影响采用丙二醛（MDA）试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）所定的方法测定各组大鼠肝脏MDA含量。采用SOD试剂盒测定肝脏SOD活性；用GSH-Px试剂盒测定肝组织GSH-Px活力，评价肝脏组织的氧化应激损伤程度。（六）统计方法用SPSS16.0对数据进行统计描述，用单因素方差分析（包括利用LSD，SNK进行两两比较），对于重复测量的资料，用重复测量设计资料的方差分析等方法统计处理。实验数据用平均数±标准差（x±S）表示，统计学意义的阈值用p<0.05表示。三、结果（一）缺铁性贫血大鼠模型造模前，各组大鼠血红蛋白水平无统计学差异（p>0.05）。与相应时间段对照组大鼠比较，放血组的Hb、 RBC、MCHC等指标显著下降（p<0.01），血清铁和肝铁含量明显降低（p<0.05），达到轻度缺铁性贫血诊断标准。（二）不同剂量不同时间铁补充对缺铁性贫血大鼠体重的影响在实验开始时各组大鼠体重无显著差别。至实验结束时各组大鼠体重都较实验开始时明显升高。但高剂量补充组大鼠在实验第25天出现体重增长减缓，并随补铁时间延长体重增长速度减慢趋势更明显（p<0.05）。（三）不同剂量不同时间铁补充对缺铁性贫血大鼠红细胞参数的影响1、Hb：实验2周，空白对照组Hb比该组实验前水平升高（p<0.05）；高、中、低不同剂量铁补充组大鼠Hb水平已恢复至相应时段空白对照组水平，且高、中、低剂量补充组间Hb无显著差别，而单纯放血组比相应时段空白组Hb水平明显下降（p<0.05）。实验4周高、中、低三组间Hb水平依然无差异（p>0.05），单纯放血组Hb比相应时段空白组Hb水平显著下降（p<0.05）2、RBC：实验2周，与放血后2天相比，低、中、高补铁组红细胞计数明显增多（p<0.05），低、中、高剂量组和空白对照组之间均无显著差异。实验4周，中剂量组RBC比低剂量组升高（p<0.05），高剂量组和低剂量组比无显著区别（p>0.05）。单纯失血组与相应时间段低、中、高剂量组和空白对照组比红细胞计数明显降低（p>0.05）。3、MCHC：实验2周，与放血后2天相比，低、中、高补铁组MCHC水平明显升高，低、中、高剂量组与空白对照组无显著差异（p>0.05）。实验4周，与实验2周比，各组MCHC均明显升高（p<0.05），高剂量组MCHC水平比低剂量补充组显著升高（p<0.05）。与放血后2天相比，单纯放血组在实验2周和4周时其MCHC均显著降低（p<0.05）。（二）不同剂量及时间铁补充对缺铁性贫血大鼠铁代谢的影响1、不同剂量不同时间铁补充对缺铁性贫血大鼠血清铁相关指标的影响（1）血清铁水平：实验2周，与相应时间段的空白对照组相比，低剂量组血清铁无显著差别（p>0.05）；中、高剂量补充组血清铁明显升高（p<0.05），低、中、高三组之间并无显著差别（p>0.05），中、高剂量补充组血清铁比单纯放血组明显升高（p<0.05）。补铁4周时，单纯失血组血清铁水平明显低于相应时间段空白对照组（p<0.05）；低剂量组血清铁与相应对照组比无显著差别（p>0.05）；中、高剂量组大鼠血清铁水平显著高于相应时间段的空白对照组和低剂量组（p<0.05）；高剂量组血清铁水平明显高于中剂量组（p<0.05）。并且中、高剂量组血清铁水平明显高于该组2周时血清铁水平（p<0.05）。(2)血清铁蛋白（SF）水平：实验2周，与相应时段的空白对照组相比，低、中剂量组SF水平无显著差别（p>0.05），单纯放血组SF显著下降（p<0.05），高剂量组SF显著升高（p<0.05）；中、高剂量组比低剂量组SF显著升高（p<0.05）,中、高剂量组间无显著差别（p>0.05）。实验4周，与相应时段的空白对照组相比，低、中剂量组SF水平无显著差别（p>0.05）单纯放血组SF显著下降（p<0.05），高剂量组SF继续升高（p<0.05）。与低剂量组相比，中、高剂量组SF明显升高（p<0.05）。补铁4周与2周相比，高剂量补充组SF水平显著上升（p<0.05）。(3)血清可溶性转铁蛋白受体（sTfR）水平：实验2周，与该时段的空白对照组相比，单纯失血组sTfR水平显著升高（p<0.05），其余各组无显著差异（p>0.05）,低、中、高各组间相比也无统计学差异（p>0.05）。但随着补铁延长至4周，与该时段的空白对照组相比，单纯放血组sTfR明显升高（p<0.05），高剂量组sTfR显著下降（p<0.05），低、中剂量组与空白组无差异（p>0.05）;高铁组sTfR水平与低剂量补充组相比显著下降（p<0.05）；且4周时高铁组sTfR水平高于2周时该组水平（p<0.05）。2、不同剂量不同时间铁补充对缺铁性贫血大鼠肝铁含量的影响实验2周，与该时段的空白对照组相比，单纯放血组肝铁含量明显下降（p<0.05），中、高剂量组肝铁含量明显升高（p<0.05），低剂量组无差别（p>0.05）;高剂量组比低剂量组肝铁显著升高（p<0.05），中剂量组与低剂量组比无差别，高、中剂量组相比无差别（p>0.05）。实验4周时，与该时段的空白对照组相比，单纯放血组肝铁含量明显下降（p<0.05），中、高剂量组肝铁含量明显升高（p<0.05），低剂量组无差别（p>0.05）；与低剂量组相比，中、高剂量组肝铁显著升高（p<0.05）；高剂量组肝铁含量明显高于中剂量组（p<0.05）。中、高组肝铁水平均显著高于2周时中、高组水平（p<0.05）。3、不同剂量铁补充对缺铁性贫血大鼠铁吸收率的影响与相应空白对照组比，低剂量组吸收率无显著差别（p<0.05），中剂量组和高剂量组在实验第5天起吸收率开始显著下降(p<0.01);中、高剂量组与低剂量组相比，第5天开始吸收率显著下降，并随时间延长吸收率下降更明显(p<0.01)从实验第9天起，高剂量组吸收率显著低于中剂量组水平。4、不同时间不同剂量铁补充对肝细胞铁代谢相关蛋白表达的影响2周时，与该时段空白对照组相比，高铁组肝脏hepcidin蛋白和肝铁蛋白表达显著升高（p<0.05），低、中剂量组无显著差异（p>0.05），单纯放血组显著降低（p<0.05）；低、中、高三剂量组间无显著差异（p>0.05）。4周时,与该时段空白对照组相比，低剂量组肝脏hepcidin和肝铁蛋白表达无显著差别，中剂量组显著升高（p<0.05），高剂量组升高更明显（p<0.01），单纯放血组显著降低（p<0.05）。与低剂量组相比，中剂量组肝脏hepcidin和铁蛋白表达显著升高（p<0.05），高剂量组升高更明显（p<0.01）。中、高剂量组间相比无显著差别（p>0.05）。2周时，与该时段空白对照组相比，单纯放血组TfR-1表达升高（p<0.05），低、中剂量组无显著差别，高剂量组显著降低（p<0.05）。低、中、高三组间无显著差别（p>0.05）。4周时，与与该时段空白对照组相比，单纯放血组TfR-1表达显著升高（p<0.01），低剂量组无显著差别（p>0.05），中、高剂量组显著降低（p<0.05），低、中剂量组无显著差别（p>0.05）。（三）不同剂量不同时间铁补充对缺铁性贫血大鼠氧化应激/抗氧化能力的影响1、肝脏MDA水平：实验2周，与该时段空白对照组相比，中、高剂量组MDA水平显著升高（p<0.05），低剂量组无显著差别（p>0.05）;中、高剂量组MDA水平显著高于低剂量组（p<0.05）；中、高组间无显著差异（p>0.05）。和单纯失血组相比，中、高剂量组MDA水平显著升高（p<0.05）。实验4周，与该时段空白对照组相比，单纯失血组、中、高剂量组MDA水平显著升高（p<0.05），低剂量组无显著差别（p>0.05）；中、高剂量组MDA水平显著高于低剂量组（p<0.05）；高剂量组显著高于中剂量组（p<0.05）。2、肝脏SOD活性：实验2周，与该时段空白对照组相比，高剂量组SOD活性显著降低（p<0.05），其他各组无显著差别（p>0.05）;与低剂量组相比，中剂量组无显著差别，高剂量组显著下降（p<0.05）。实验4周，与该时段空白对照组相比，单纯放血组、中、高剂量组SOD活性均显著降低（p<0.05），低剂量组无显著差异（p>0.05）。与低剂量组相比，中、高剂量组SOD活性显著下降（p<0.05）。高剂量组SOD活性比中剂量组显著下降（p<0.05）。3、肝脏GSH-Px活力：实验2周时，与该时段空白对照组相比，单纯放血组、中、高剂量组GSH-Px活力显著下降（p<0.05），低剂量组无明显差别（p>0.05）。与低剂量组相比，中、高剂量组GSH-Px活力显著下降（p<0.05），高剂量组与中剂量组无明显差别（p>0.05）。实验4周时，与该时段空白对照组相比，单纯放血组、中、高剂量组GSH-Px活力显著下降（p<0.05），低剂量组无先祖差别（p>0.05）。与低剂量组相比，高剂量组GSH-Px活力显著下降（p<0.05），中剂量组无显著差别（p>0.05）。高剂量组与中剂量组相比无显著差别（p>0.05）。四、结论通过不同时间和不同剂量灌胃补铁治疗大鼠轻度缺铁性贫血（利用放血法并喂养低铁饲料复制大鼠缺铁性贫血模型），观察各组大鼠红细胞参数、铁代谢指标和抗氧化指标的变化。结果发现：1．补铁2周时，低、中、高三个剂量组的红细胞参数均已恢复至相应时段对照组水平，三组间无差别。2．补铁2周低剂量组血清铁、血清铁蛋白和肝铁含量已恢复至相应时段空白对照组水平；中、高剂量组血清铁水平比相应时段空白对照组显著升高；高剂量组肝铁水平比相应时段对照组显著升高。补铁至4周时，低剂量组肝铁含量与相应时段空白对照组无差别；而高剂量组血清铁水平高于对照组2.7倍，肝铁含量高于对照组1倍，单纯失血组血清铁水平和肝铁水平比空白组显著下降。3．整个实验期间，低剂量组与对照组相比，铁表观吸收率无差异；补铁4周时，中、高剂量组吸收率显著下降，高剂量组下降更明显，同时可见高剂量组肝铁蛋白、hepcidin蛋白表达显著升高，TfR-1蛋白表达显著降低。4．实验2周时，单纯放血组MDA水平比空白对照组显著升高，提示缺铁性贫血可以引起机体氧化损伤。低剂量组大鼠MDA、SOD、GSH-Px活力水平与空白对照组比无统计学差异，说明用小剂量即可修复已经受损的氧化防御系统，而高剂量组在2周和4周时，MDA水平明显升高，SOD和GSH-Px活力明显下降，表明，大剂量长时间铁补充可导致或加重机体氧化应激。综上，轻度缺铁性贫血大鼠补充相当于膳食剂量的铁剂2周，红细胞参数、铁营养状况和机体抗氧化水平即可恢复。补铁剂量加大或者时间延长，可导致机体铁过负荷，并引起氧化应激损伤。