电致化学发光(Electrochemiluminescence,缩写为ECL)是指对电极施加一定的电压进行电化学反应,电极反应的产物之间或电极反应产物与体系中的某种组分之间发生化学反应,产生激发态物质,激发态物质回到基态时产生的发光现象。由于检测过程中不需要使用任何外加光源,ECL有效地避免了散射光和光学纯度带来的问题,光学背景信号低,该检测方法己经广泛的应用于生物分析中。近几年,比率分析法受到了大量科研工作者的关注。与双波长荧光比率法类似,ECL也可以通过比率法来降低环境变化的影响提高检测的灵敏度。ECL LC率主要包括双电位和双波长信号比率分析,其中双电位ECL 比率体系在生物和化学分析检测中己经被广泛应用,而双波长ECL 比率的发展在一定程度上受到限制。另外,纸基ECL传感器保持了纸基分析装置的价格低廉、易于修饰、便携、消耗样晶体积小等优点。本论文主要从ECL的构建基底和检测方法上入手,设计了纸基/比率型ECL分析方法并用于肿瘤标记物和肿瘤细胞的检测。基于纸基分析装置的优点,我们设计了新型纸基ECL生物传感器,实现了前列腺特异性抗原,HL-60肿瘤细胞和病毒DNAs的检测。此外,利用类石墨烯g-C3N4纳米层和Ru(bpy)32+之间的共振能量转移,实现了双波长ECL LC率法,并用于miRNA的灵敏检测。1.纸基电致化学发光生物传感器检测肿瘤细胞构建了一种新型的纸基ECL生物传感器用于HL-60肿瘤细胞的检测。首先,将打了孔(6mm直径的圆)的胶带粘附于ITO电极表面,形成固定面积的检测区域。然后一定面积(13 mm × 8 mm)的多孔纤维滤纸作为薄层电化学池,置于检测区域的表面,检测液体积降低到20 μL。Ag/AgCl丝和Pt丝固定在纸基表面分别作为参比电极和对电极。然后将金纳米颗粒(Au NPs)和石墨烯覆盖在ITO表面,用来捕获HS-DNA。标记了 RuSi@Ru(bpy)32+的HL-60细胞适配体和捕获DNA杂交,形成双链DNA组装到ITO电极表面。当HL-60细胞存在时,适配体会识别细胞表面的糖蛋白,RuSi@Ru(bpy)32+-适配体从工作电极表面解离下来,ECL信号下降,据此可以检测HL-60细胞。这种简单的、便携的、一次性的检测平台对肿瘤细胞的检测具有着较好的应用潜力。2.纸基双极电极电致化学发光法检测肿瘤标记物为了进一步降低成本,我们将多孔滤纸作为基底平台构建了闭合式双极电极(BPE)ECL传感器,实现了前列腺特异性抗原(PSA)的定量检测。和传统的三电极体系相比,BPE具有较多的优势,例如,结构简单、无需外加引线将电极引出、电池尺寸小、易于传感器装置的微型化等。该纸基BPE装置含有疏水蜡隔开的两个亲水区域,分别为检测池和传感池,中间通过碳浆印刷的双极电极连接,有效地分开了反应物和检测液,避免了它们之间的相互干扰。同时,将多壁碳纳米管(MWCNTs)修饰在双极电极的阴极表面,通过增强导电性提高ECL的信号响应。在电极表面组装抗体和抗原后,携带二抗和葡萄糖氧化酶的二氧化硅纳米球通过夹心免疫反应组装到电极表面。在葡萄糖存在时,葡萄糖氧化酶催化葡萄糖原位产生H2O2,加速了双极电极阴极表面的电子传递。所以,双极电极的阳极表面ECL信号明显的增强,实现了前列腺特异性抗原(PSA)的灵敏检测,最低检测限为1 pg/mL。纸基上构建双极电极装置为双极电极的应用带来了新的方向和机会。3.纸基阵列双极电极电致化学发光法多元检测病毒DNAs进一步构建纸基阵列双极电极(BPE)芯片,通过ECL法实现了多种病毒DNAs的检测。纸基BPE阵列装置含有15个单元,每个单元由六个传感单元和两个检测单元组成,它们之间靠疏水蜡隔开。当完全互补的目标DNA存在时,组装在BPE阴极上的发卡捕获DNA与铂纳米颗粒(Pt NPs)标记的探针DNA杂交。由于Pt NPs的引入会催化阴极溶解氧的还原,所以BPE阳极Ru(bpy)32+/三正丙胺(TPrA)的ECL信号增强。由于纸基和空气的相对接触面积比较大,在还原反应中溶解氧的消耗可以通过空气及时的补充,从而确保了 ECL信号的稳定性。该制备的纸基BPE阵列传感器实现了多种病毒基因(梅毒基因,免疫缺陷病毒基因HIV,乙型肝炎病毒基因HBV)的检测。4.双波长电致化学发光比率法检测microRNA双信号比率检测技术取决于两种信号的比率,而非单一信号的影响,它可以有效地降低外界环境改变带来的影响,例如,路径长度、背景光和散射。所以,在分析应用中,双信号比率检测比单信号检测具有更好的精确度。基于类石墨烯碳氮纳米层(g-C3N4 NS)和Ru(bpy)32+之间的共振能量转移(RET),我们设计了双波长电致化学发光(ECL)比率法,灵敏地检测了不同浓度的miRNA-21。滴涂在玻碳电极上的Au-g-C3N4 NH在460 nm发射峰处会发出强且稳定的ECL信号。由于Au-g-C3N4 NH的发射光谱和Ru(bpy)32+的吸收光谱相重叠,它们之间会发生ECL共振能量转移(ECL-RET),即Au-g-C3N4 NH在460 nm的发射光强会被Ru(bpy)32+吸收,并激发了 Ru(bpy)32+在620 nm处的发射。结果,Au-g-C3N4 NH 的 ECL 信号(460 nm)变小,而 Ru(bpy)32+的 ECL 信号(620 nm)增强,形成了双波长ECL-RET比率体系。然后,该体系进一步用于目标物miRNA-21的检测。通过Au-S键,巯基修饰的分子信标组装在Au-g-C3N4NH的表面,接着miRNA-21和分子信标杂化形成DNA-RNA双链。该双链会进一步被双链特异性核酸酶裂解,释放出miRNA-21,参与到下一个杂交循环中。最后,通过探针DNA-Ru(bpy)32+和电极表面剩下的单链DNA杂化,引入了 Ru(bpy)32+。通过检测ECL460 nm/ECL620 nm的比率,我们能够精确的定量检测1.0 fM到1.0 nM浓度范围内的miRNA-21。该工作为双波长ECL比率的研究和核酸的检测提供了有力的参考。