目的 随着腹膜透析(PD)技术的不断成熟，腹透已成为终末期肾衰竭(ESRF)一体化治疗的重要组成部分，腹膜结构和生理功能的稳定是PD能够长期有效进行的关键。作为腹膜的第一道生理屏障—腹膜间皮细胞(PMCs)长期暴露在酸性、高渗透压、高糖的非生理性腹透液中，其结构和功能发生显著变化：如细胞体积增大，细胞外基质增多，细胞增殖受抑制，再生修复障碍，以致发生腹膜纤维化、腹膜通透性增加，葡萄糖吸收加快，而高糖是造成PMCs损害，超滤下降、丧失的主要原因。 葡萄糖无法自由通过细胞膜脂质双层结构进入细胞，需借助细胞膜上的葡萄糖转运蛋白来完成，葡萄糖转运蛋白是调控细胞内糖摄入及糖代谢的第一限速步骤。实验证实易化扩散性葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)是腹膜间皮细胞表达的主要转运蛋白，因此，细胞膜上GLUT1含量变化决定了间皮细胞对葡萄糖的转运。 已知蛋白激酶C(PKC)的激活参与了糖尿病肾病的发生发展，体外培养的骨骼肌细胞在高糖刺激下，葡萄糖转运的增加是通过PKC途径完成的，同时实验证实腺病毒转染的骨骼肌细胞过度表达PKC可促进GLUT1由储存囊泡向细胞膜转运，且能增加GLUT1活性。 本实验利用原代培养的PMCs研究高糖、PKC激动剂-PMA对PMCs细胞膜上GLUT1的调节，并观察经典型PKC(cPKC)抑制剂——G(?)6976对GLUT1的影响，为进一步探讨如何减少葡萄糖的吸收，从而增加UF提供理论依据。 方法 1．胰蛋白酶消化法进行雄性Wistar大鼠PMCs的原代培养 2．间接免疫荧光法用于PMCs细胞膜上GLUT1的鉴定 3．流式细胞仪技术定量检测细胞膜上GLUT1的含量 4．观察高糖、PMA及PKC抑制剂对细胞膜上GLUT1含量的调节 5．己糖激酶法检测培养液内的葡萄糖浓度结果 1.腹膜间皮细胞GLUTI的鉴定 我们拥有成熟的腹膜间皮细胞培养技术，光镜下观察培养的细胞为多角形，融合时呈铺路石样外观，为典型的上皮细胞形态表现。荧光显微镜下，GLUTI抗体标记的细胞呈绿色荧光，而应用正常兔血清代替一抗孵育的细胞则未见到绿色荧光标记，说明PMCs表达GLUTI。 2.葡萄糖对细胞膜上GLUTI的调节 不同浓度的葡萄糖分别刺激PMCs lh、24h，流式细胞仪检测细胞悬液，Cen quest软件分析，以平均荧光强度(MFI)代表细胞膜上GLUTI的含量。可见随着葡萄糖浓度的升高，细胞膜上GLUTI的表达量明显增加，4.25%的Gl。培养24h上调GLUTI的表达2.巧倍(P<0.01)，但在4.25%Gl。刺激lh时，GLuTI的表达量较前有明显下降，几乎降至正常糖浓度的水平。 3.细胞外高糖刺激PMCs对葡萄糖转运增加(P<0.05) 4.PMA以剂量和时间依赖方式诱导细胞膜上GLUTI的表达 1.0林 moFLpMA刺激PMCs24h后，细胞膜上GLUTI升高达4.99倍(P<0.05)。细胞暴露于0.1林moFLpMA，分别在lh、6h、24h、36h检测细胞MFI，GLUTI于作用24h时表达量最高(P<0 .05)。 5翻6976对PMA诱导GLUTI作用的影响 C七6976明显抑制了PMA对GLUTI的诱导，MFI下降33%(P<0.05)。结论 1.大鼠PMCs普遍表达GLUTI。 2.葡萄糖以浓度依赖方式上调PMCs细胞膜上GLUTI的蛋白表达，同时伴有PMCs对葡萄糖转运的增加。 3.PKC激动剂一PMA以时间和剂量依赖方式上调PMCs细胞膜上CLUTI蛋白表达，GLUTI表达的上调参与了PD时高糖对PMcs的损害过程。 4.CPKC抑制剂一自6976阻断了PMA对GLUTI的诱导，使葡萄糖转运减少，跨膜浓度梯度能有效维持，故应用PKC抑制剂成为增加超滤的途径之一。