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研究背景与目的肾细胞癌(RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,占成人全身恶性肿瘤的3%,且近年来肾癌的发病率有明显上升的趋势,死亡人数逐年提高。目前,肾细胞癌的主要治疗方法为外科手术,对放疗、化疗、激素治疗均不敏感。然而肾癌是免疫原性较强的肿瘤,对免疫治疗则有较好的反应性,因而研究肿瘤疫苗等免疫方法治疗肾癌成为各国科学工作者研究的热点。目前研究发现,6250抗原良好的肾癌肿瘤特异性和免疫原性在肾癌的诊断、预后及免疫治疗等方面有较好的应用前景。98%的RCC原发灶表达6250抗原,特别是肾透明细胞癌几乎全部表达G250抗原,而正常肾脏组织不表达该抗原,故G250抗原良好的肾癌特异性成为肾癌疫苗免疫治疗的热点。随着对G250抗原研究的不断深入,研究证实肾癌G250抗原中由氨基酸249-268(G250肽／249)形成的抗原肽,同时包含CTL表位和Th表位,可诱导CD4+及CD8+的T细胞免疫反应,可刺激机体产生针对该肽的抗肾癌免疫反应,故G250肽／249为肾癌肽疫苗治疗的理想靶点。目前以6250抗原表位肽为基础的肾癌肽疫苗研究结果已完成相应临床报告,然而由于抗原肽分子量小,免疫原性弱,研究结果表明单纯6250抗原表位肽存在免疫原性弱,在体内不能产生理想的抗肾癌治疗效应等弱点,疫苗载体在提高抗原肽免疫原性等方面存有着重要作用,故寻找理想的疫苗载体,增强其免疫原性成为以G250抗原表位肽为基础的肾癌肽疫苗治疗的研究热点。乙型肝炎核心抗原(HBcAg)具有天然的颗粒组装能力,在实验及临床应用研究中证实了其可作为理想的疫苗载体。故基于以上理论基础,本实验利用基因工程技术将编码鼠G250肽／249的基因片段插入到HBcAg的主要免疫优势区(MIR),最终构建出原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,通过原核表达和纯化,成功获得重组融合蛋白,并进一步分析其免疫原性。本实验探索性的利用HBcAg作为肾癌特异性抗原G250肽/249的疫苗载体,为肾癌肽疫苗方面做出补充和探索性创新。研究方法1.G250抗原肽-HBcAg重组融合蛋白的制备：(1)PCR扩增编码G250抗原肽/249特异性抗原表位的基因片段。(2)构建重组质粒pGEM-T/G250肽。(3)将G250抗原肽／249连接入删除了MIR区的pGEMEX/HBcAg中,构建重组质粒pGEMEX-1/C-G250肽-C。(4)为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,设计合成两条正负引物,PCR扩增C-G250肽-C基因片段。(5)最终将C-G250肽-C目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+),最终成功构建出原核表达质粒pET28a(+)／C-G250肽-C。IPTG诱导融合蛋白表达,经SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色分析原核表达产物,采用Ni2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白。2.重组融合蛋白的免疫原性检测：用纯化融合蛋白腹腔免疫BALB/c小鼠,共免疫六次,收集免疫前后血清,间接ELISA法检测血清中抗融合蛋白、抗G250抗原肽和抗-HBcAg的抗体滴度。研究结果1.原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C经双酶切鉴定和基因测序证明重组质粒构建成功,重组融合基因序列与理论设计完全一致。经过原核表达和Ni2+-NTA亲和层析法纯化,成功表达出分子量约22.35KD的重组蛋白及最终获得了纯度达95%以上的融合蛋白。2.用纯化融合蛋白腹腔免疫BALB/c小鼠,BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1：5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1：6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1：4×103。结论1.成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组融合基因原核表达质粒pET28a(+)／C-G250肽-C,通过原核表达获得了相应的重组融合蛋白并纯化。2.该融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体,HBcAg可有效增强G250肽／249的免疫原性,另外由于G250肽／249抗原表位代替了HBcAg的MIR区,HBcAg的抗原性显著下降,抗-HBc抗体滴度不超过1：4×103。