脊髓水平环氧合酶在切口痛大鼠术后痛觉超敏中的作用目的术后疼痛是急性疼痛的一种常见形式，各种类型手术的病人术后没有得到有效的镇痛是急性疼痛转为慢性疼痛的主要原因之一。尽管通过基础和临床的大量研究对疼痛的病理生理机制有了深入的了解，但是术后疼痛的治疗仍是个急待解决的问题。组织损伤后，脊髓背角神经元敏感化（中枢敏感化）和外周伤害性感受器敏感化（外周敏感化）在机械感觉超敏的形成和维持过程中起着十分重要的作用。以往研究表明，前列腺素（PGs），尤其是PGE₂，作为重要的炎症和促伤害介质，在外周和中枢敏感化方面起着十分重要的作用。PGs直接刺激大鼠脊髓背角广动力范围（WDR）神经元，使它们对伤害性机械刺激发生敏感化，增加脊髓初级传入神经元释放谷氨酸和P物质，导致痛觉敏感，形成痛觉过敏（hyperalgesia）和痛觉超敏（allodynia）。组织中的PGs是通过环氧合酶（COX）合成的，COX是以花生四烯酸（AA）为底物生成PGs途径中的限速酶。主要有两种亚型：COX-1和COX-2。COX抑制剂干预伤害性感受可能是通过减少中枢神经系统，尤其是脊髓中PGs的合成来实现的。因此，进一步研究脊髓水平COX在切口痛引起的痛觉超敏过程中的作用可能将有助于找到急性术后疼痛的最佳治疗方案。本研究采用大鼠切口痛模型，通过行为学、免疫组织化学和免疫印记沉淀的方法，观察脊髓水平COX-1和COX-2及其活性产物PGE₂在术后痛觉超敏的形成和维持过程中的变化，同时，鞘内分别给予选择性COX-1抑制剂SC-560和COX-2抑制剂NS-398观察其术后镇痛作用。此外，通过不同时间点鞘内注射COX-1抑制剂SC-560比较术后镇痛效果，以探讨其最佳给药时机，从而为选择性COX-1抑制剂鞘内给药用于术后疼痛治疗提供理论依据。此外，有报道称，急性伤害性刺激可以使脊髓背角神经元的细胞外信号调节激酶（ERK）发生磷酸化，因此本研究还通过观察术后疼痛过程中脊髓背角p-ERK的表达变化，以及鞘内给予选择性COX-1抑制剂SC-560对大鼠脊髓中p-ERK表达的影响，以探讨选择性COX-1抑制剂术后镇痛的细胞信号转导机制。论文一、术后疼痛大鼠脊髓水平环氧合酶和前列腺素E₂的表达材料和方法1、实验动物选用雄性Wistar大鼠，体重220～260g，由中国医科大学实验动物中心提供。2、术后疼痛模型的制作雄性Wistar大鼠2％异氟醚麻醉后，采用Brennan的方法制作术后疼痛模型，即无菌消毒下在大鼠左后足掌中间距离足跟0.5cm处向脚趾方向纵行切开皮肤、筋膜，长约1.0cm，用眼科镊提起跖肌，纵行切开，但未损伤其起止部位，轻压止血后用5-0尼龙线缝合皮肤，局部给予抗生素软膏预防感染。3、动物分组行为学实验（n=8）：分别在术前1天、术后2、4、6小时及1、2、3、5和7天分别测定大鼠术侧和对侧后足机械缩足反射阈值（MWT）。免疫组化和WesternBlot实验：48只大鼠根据取材时间点分为六组（n=8），分别在术前、术后2、4、6、12和24小时取腰膨大脊髓，分别采用免疫组织化学技术（n=4）和蛋白免疫印记（Western blot）（n=4）观察大鼠脊髓中COX-1、COX-2蛋白表达变化情况。酶联免疫吸附（ELISA）实验：20只大鼠根据取材时间点分为五组（n=4），分别在术前、术后2、4、6和24小时各时间点取腰段脊髓，观察大鼠脊髓中PGE₂的含量变化。4、统计学处理数据均以均数±标准差表示，所得数据经SPSS11.5软件处理，组内比较用t检验，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，P＜0.05认为有统计学差异。结果1、术后疼痛大鼠术前、术后缩足反射阈值（MWT）的变化所有动物双侧后足术前MWT基础值无明显差异。术后2h左（手术侧）后足MWT即显著下降，与术前和右（非手术）侧后足MWT比较均有统计学差异（P＜0.01），虽然此后MWT逐步升高，但是这种差异一直持续到术后3d（P＜0.05）。非手术侧各时间点MWT均无明显变化。2、术后疼痛大鼠脊髓水平COX-1和COX-2表达术前大鼠腰段脊髓中COX-1和COX-2均有少量表达，主要分布于脊髓背角浅层。与术前组相比，术后2h脊髓背角浅层COX-1的表达明显增加，4h达到高峰（P＜0.01），此后虽有所减少，但一直持续到24h；术后2h脊髓背角COX-2表达虽有所增加，但明显低于COX-1的表达，而且仅持续到术后6h，此后与术前组比较无统计学差异。3、术后疼痛大鼠腰段脊髓PGE₂含量的变化术后大鼠腰段脊髓中PGE₂含量迅速增高，术后2h至24h各时间点PGE₂含量均高于术前水平，4h达高峰，此后维持在较高的水平，术后24h PGE₂含量仍高于术前（P＜0.05）。论文二、鞘内注射选择性环氧合酶抑制剂对术后疼痛大鼠痛觉超敏以及脊髓中前列腺素E₂的影响材料和方法1、实验动物同第一部分2、术后疼痛模型同第一部分3、鞘内给药Wistar大鼠2％异氟醚麻醉后，采用Mestre法单次鞘内注射，即左手固定大鼠背部，右手持微量注射器于L₅-L₆椎间隙垂直于脊柱的方向穿刺，当进入蛛网膜下腔时尾巴会突然出现侧向甩动或轻微抖动。术后出现神经功能障碍或／和炎症反应的大鼠排除在实验之外。所有动物鞘内给药容积均为10μl，SC-560和NS-398分别溶于100％二甲基亚砜（DMSO）10μl。4、动物分组（1）行为学实验一建立术后疼痛模型后，将术后2h出现痛觉超敏的大鼠40只随机分为五组（n=8）：DMSO组，鞘内注射DMSO10μl；SC5组，鞘内注射SC-560 5μg；SC50组，鞘内注射SC-560 50μg；SC100组，鞘内注射SC-560 100μg；NS组，鞘内注射NS-398 50μg。分别于给药前、给药后30min、1h、2h、4h、6h和24h测定大鼠MWT，并将SC各组给药后30min的MWT转换为最大效应百分比（％MPE）。（2）行为学实验二48只大鼠随机分为三大组（n=16）：BI组，AI2组和AI24组，分别术前15min、术后2h和24h鞘内注射DMSO 10μl（n=8）或SC-560100μg（n=8）。给药后30min测定MWT，并将其转换为镇痛效应百分比（％antiallodynia）。（3）ELISA实验部分12只正常大鼠随机分为三组（n=4）：DMSO组，术前15min鞘内注射DMSO 10μl；SC组，术前15min鞘内注射SC-560 100μg；NS组，术前15min鞘内注射NS-398 50μg。分别于术后4h取大鼠腰段脊髓用ELISA技术检测PGE₂的含量。5、统计学处理同第一部分结果1、术后鞘内注射SC-560和NS-398对切口痛大鼠痛觉超敏的影响以及不同时间点鞘内注射SC-560镇痛效应百分比的观察术前和给药前各组的MWT没有明显差异，和给药前以及DMSO组相比，SC50和SC100两组给药后MWT明显升高（P＜0.01），SC50组给药后MWT持续升高2h，而SC100组的作用时间持续到给药后6h（P＜0.01），随着SC560鞘内注射剂量的增加其％MPE也随之增高，而SC5组、NS组与术前和DMSO组比较，在各个时间点均无统计学差异。术前和术后2h鞘内注射SC-560镇痛效应％明显高于术后24h给药（P＜0.01）。2、SC-560和NS-398鞘内注射对术后疼痛大鼠脊髓中PGE₂含量的影响和DMSO组相比，SC组明显减少切口痛大鼠术后4h脊髓中PGE₂的含量（P＜0.01），NS组脊髓PGE₂的含量较DMSO组虽有所减少，但是无统计学差异。论文三、选择性环氧合酶-1抑制剂SC-560对术后疼痛大脊髓中ERK表达的影响材料和方法1、实验动物同第一部分2、术后疼痛模型同第一部分3、鞘内给药同第一部分4、动物分组32只大鼠随机分为四组（n=8）：对照组，正常大鼠；PP组，不给药；SC组，术前15min鞘内注射SC-560 100μg；DMSO组，术前15min鞘内注射DMSO 10μl。各组分别于术后1h取大鼠腰段脊髓，用免疫组化（n=4）和Western blot技术（n=4）测定大鼠腰段脊髓p-ERK免疫阳性细胞数及p-ERK蛋白的含量。5、统计学处理同第一部分结果1、鞘内注射SC-560对术后疼痛大鼠腰段脊髓p-ERK免疫阳性细胞的影响正常大鼠腰段脊髓背角仅有少量p-ERK免疫阳性细胞表达。术后1h患侧腰段脊髓背角p-ERK免疫阳性细胞数明显增多（P＜0.01），主要集中分布在背角浅层（Ⅰ、Ⅱ层）。和术后疼痛组比较，预先鞘内注射SC-560 100μg术后1h脊髓背角p-ERK的阳性细胞数明显减少（P＜0.01），而鞘内注射DMSO不能减少p-ERK蛋白的表达（P＞0.05）。2、鞘内注射SC-560对术后疼痛大鼠腰段脊髓p-ERK蛋白表达的影响术后1h大鼠腰段脊髓中p-ERK1／2蛋白的表达较正常大鼠均明显增加（P＜0.01），与术后疼痛组相比，鞘内注射SC-560可以抑制p-ERK1／2蛋白的表达（P＜0.01），而DMSO的作用不明显。结论1、脊髓水平的COX，主要是COX-1，和PGE₂参与切口痛大鼠术后痛觉超敏的形成和早期维持过程。2、鞘内注射选择性COX-1抑制剂SC-560可以减轻术后疼痛大鼠术后机械痛觉超敏，早期干预脊髓中由COX-1介导的PGE₂合成或许对术后痛觉超敏的治疗更加有效。3、术前鞘内注射COX-1抑制剂SC-560可以减少术后p-ERK的表达，提示鞘内注射COX-1抑制剂减轻切口痛大鼠术后痛觉超敏反应可能是由脊髓水平ERK介导的。