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研究背景:卵巢癌(ovarian cancer)是女性常见的生殖系统恶性肿瘤,早期诊断困难,易发生转移,药物治疗效果差,死亡率高。因此寻求一个特异性的靶点进行早期诊断或有效治疗是目前卵巢癌研究亟待要解决的问题。就卵巢癌而言,淋巴道播散是转移的重要途径,淋巴管生成(lymphangiogenesis)促进了卵巢癌的转移浸润。而淋巴管生成主要是毛细淋巴管的形成。研究显示,肿瘤微淋巴管的形态结构与正常组织中的微淋巴管明显不同,基于这种差异,肿瘤新生淋巴管可成为肿瘤诊断与治疗中一个新的可行的靶标。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-C和VEGF-D是最主要的淋巴管生成因子,它们通过与血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factorreceptor-3)结合,来促进实体瘤内淋巴管的新生,并促进肿瘤细胞的淋巴结转移。研究证实,VEGFR-3表达于卵巢癌新生淋巴管内皮,这为以VEGFR-3为靶点进行卵巢癌淋巴管显像及治疗研究提供了可能。目前显像及治疗研究中所使用的靶向分子探针多为特异性抗体或大分子蛋白,它们分子量大、穿透力差、血液清除慢,肿瘤组织放射性计数/非肿瘤组织放射性计数(T/NT)比值较低,靶组织分布不仅难以等缺点,限制了其在临床的应用。与之相比,多肽分子量小、免疫原性低、血液清除快、不会被肝、网状内皮系统非特异性摄取、合成简单、易于修饰,是理想的靶向剂。而噬菌体展示肽库(Phage displaypeptide library)技术的完善与发展,也为开发小分子多肽提供了良好的工具。
在我们的前期研究中,通过噬菌体展示技术筛选获得了与卵巢癌新生淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells,LECs)上VEGFR-3胞外区蛋白具有高亲和力结合的噬菌体融合多肽(SHSWH WLPNL RHYAS),它能竞争性抑制VEGF-D与VEGFR-3的结合[4]。前期研究还表明多肽在卵巢癌小鼠移植瘤中具有选择性聚集作用,具有靶向性分布[5],进而本实验进一步研究该多肽与核素标记后在体内外对淋巴管内皮细胞的抑制及对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。从而探讨以淋巴管生成为靶标的分子显像及治疗方法,为深入进行卵巢癌放免显像及治疗研究提供实验基础。
研究目的:通过体内外实验来研究131I标记VEGFR-3高亲和融合多肽(phage-SHSWHWLPNLRHYAS)靶向淋巴管内皮细胞的特异结合杀伤作用及对荷人卵巢癌裸鼠移植瘤的靶向显像及治疗作用
研究方法:
1.免疫靶向复合物的制备及MTT比色法检测131I-多肽及131I-单抗对淋巴管内皮细胞(LECs)的抑制作用。用Iodogen法合成131I-多肽及131I-单抗,SephadexG50柱纯化,利用纸层析法测定其标记率及放化纯。体外分别与LECs共培养,MTT法检测其对LECs生长的抑制作用。
2.131I标记VEGFR-3高亲和融合多肽在荷卵巢癌裸鼠体内靶向新生淋巴管的显像及体内分布研究。肿瘤细胞SKOV3悬液经皮下注射法建立荷人卵巢癌裸鼠模型,待肿瘤长至1.0cm3时进行实验,Iodogen法合成131I-多肽及131I-单抗,纸层析法测定标记率。多肽组鼠尾静脉注射131I-多肽3.7 MBq,单抗组鼠尾静脉注射131I-单抗7.4MBq,用0.1％戊巴比妥麻醉后,在SPECT仪下观察肿瘤显像情况。将多肽组及单抗组24只荷瘤鼠随机分为4组,分别在注射131I-多肽及131I-单抗后24h,48h,96h和168h脱颈椎处死一组小鼠,并取眼球后血,心,肝,肾,肠,肌肉,后大腿骨骼,脑和肿瘤组织,称湿重,并用r放射免疫计数器测定各组织的放射性计数,计算每克组织百分剂量率(％ID/g)和T/NT比值。
3.131I标记VEGFR-3高亲和融合多肽对荷人卵巢癌小鼠移植瘤的靶向治疗作用。肿瘤细胞SKOV3悬液经皮下注射法建立荷人卵巢癌裸鼠模型,成瘤后2周,将20只荷瘤小鼠随机分成4组,每组5只。Iodogen法合成131I-多肽及131I-单抗,纸层析法测定标记率,分别经尾静脉注射,Ⅰ组:多肽4.4μg/只,Ⅱ组:131I-多肽7.4 MBq/只,Ⅲ组:131I-单抗7.4 Maq/只,Ⅳ组:生理盐水0.2 ml作为对照组。干预后每周测量1次小鼠肿瘤的长径及短径,观察4周,计算肿瘤体积及抑瘤率。
研究结果:
1.多肽标记率为82％;放化纯度为97％,放射性浓度为39.96 MBq/ml;单抗标记率为61％,放化纯度为87％,放射性浓度为22.57MBq/ml。131I-多肽组对LECs的生长抑制率在72h达到最高,131I-单抗组对LECs的生长抑制率在96h达到最高;48h,72h及96h131I-多肽组与131I-单抗组及多肽组比较抑制率均具有显著差异(P＜0.05)。
实验所构建的裸鼠移植瘤模型成瘤率为100％。多肽组裸鼠尾静脉注射131I标记多肽后24h在移植瘤部位和。肾脏,肝脏,膀胱开始出现放射性聚集。随着时间推移移植瘤聚集放射性逐渐增多,在注射后96h时与周围组织对比最为明显,至168h时依然可见移植瘤部位显著浓聚放射性。单抗组移植瘤部位也有类似显像,但放射性明显弱于多肽组;131I-多肽能选择性长时间大量聚集与移植瘤部位,24h时肾脏每克组织百分剂量率最高,脑中最低,肿瘤排在第7位;96h时移植瘤的摄取率达到最大为39.83％,升至第1位,其次为肾脏及肝脏;T/NT值随时间延长逐渐增高,96h时肿瘤/血液比值高达31.67。单抗组移植瘤摄取率在96h同样也达到最高为23.18％,明显弱于多肽组。由此提示,131I标记多肽主要分布于肿瘤,肝脏及肾脏组织,在体内通过肾脏与肝脏代谢,并从血液中快速清除。131I标记单抗于肿瘤部位呈现低放射性分布弱于131I标记多肽提示131I标记多肽在肿瘤组织部位聚集是由肿瘤组织中淋巴管内皮高表达的VEGFR-3介导的,体现了良好的亲和性。T/NT反应肿瘤与非肿瘤组织浓聚标记抗体的差异,其值的高低直接影响SPECT显像效果。肝脏,肾脏的T/NT值始终较低,同样提示这些组织内的放射性计数较高,这与多肽及单抗从肾脏及肝脏代谢有关。
2.各组小鼠在接种部位均有移植瘤形成,成瘤率为100％。各组小鼠肿瘤平均体积大小在开始治疗时差别无统计学意义(P＞0.05),在40 mm3左右。治疗开始后,各组小鼠肿瘤的平均体积都表现为随时间增长的趋势,但131I-多肽治疗组肿瘤平均体积与多肽组,131I-单抗组、对照组相比肿瘤体积的增长速度明显延缓。治疗结束时131I-多肽治疗组肿瘤的平均体积为(291±68)mm3,131I-单抗治疗组平均肿瘤体积为(457±88)mm3而对照组肿瘤平均体积为(792±112)mm3,相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。131I-多肽治疗组肿瘤体积与131I-单抗治疗组肿瘤体积相比差异也具有统计意义(P＜0.05),多肽组与对照组平均肿瘤体积相比其增长速度相似,治疗结束时多肽组和对照组平均肿瘤体积差异无统计学意义(P＞0.05)。与对照组相比,131I-多肽治疗组的抑瘤率为63％,131I-单抗治疗组的抑瘤率为44％。移植瘤组织的免疫组化结果显示移植瘤组织新生淋巴管丰富,131I-多肽对移植瘤组织中的淋巴管内皮细胞及肿瘤实质细胞均有较强的凋亡作用。
结论:
1,Iodogen法131I标记多肽及单抗简单易行,标记率及放化纯度高;131I标记多肽对LECs有明显的抑制和杀伤作用。
2,131I标记高亲和融合多肽对荷人卵巢癌移植瘤具有良好的靶向作用,能选择性长时间浓聚于移植瘤部位,T/NT值较高,显影清晰,因此有望成为靶向卵巢癌新生淋巴管的导向剂,为卵巢癌的靶向诊断或治疗提供理想的靶向载体。
3,131I标记高亲和融合多肽对荷人卵巢癌小鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用。其抑制作用强于等浓度抗VEGFR-3单克隆抗体。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-C和VEGF-D是最主要的淋巴管生成因子,它们通过与血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factorreceptor-3)结合,来促进实体瘤内淋巴管的新生,并促进肿瘤细胞的淋巴结转移。研究证实,VEGFR-3表达于卵巢癌新生淋巴管内皮,这为以VEGFR-3为靶点进行卵巢癌淋巴管显像及治疗研究提供了可能。目前显像及治疗研究中所使用的靶向分子探针多为特异性抗体或大分子蛋白,它们分子量大、穿透力差、血液清除慢,肿瘤组织放射性计数/非肿瘤组织放射性计数(T/NT)比值较低,靶组织分布不仅难以等缺点,限制了其在临床的应用。与之相比,多肽分子量小、免疫原性低、血液清除快、不会被肝、网状内皮系统非特异性摄取、合成简单、易于修饰,是理想的靶向剂。而噬菌体展示肽库(Phage displaypeptide library)技术的完善与发展,也为开发小分子多肽提供了良好的工具。
在我们的前期研究中,通过噬菌体展示技术筛选获得了与卵巢癌新生淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells,LECs)上VEGFR-3胞外区蛋白具有高亲和力结合的噬菌体融合多肽(SHSWH WLPNL RHYAS),它能竞争性抑制VEGF-D与VEGFR-3的结合[4]。前期研究还表明多肽在卵巢癌小鼠移植瘤中具有选择性聚集作用,具有靶向性分布[5],进而本实验进一步研究该多肽与核素标记后在体内外对淋巴管内皮细胞的抑制及对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。从而探讨以淋巴管生成为靶标的分子显像及治疗方法,为深入进行卵巢癌放免显像及治疗研究提供实验基础。
研究目的:通过体内外实验来研究131I标记VEGFR-3高亲和融合多肽(phage-SHSWHWLPNLRHYAS)靶向淋巴管内皮细胞的特异结合杀伤作用及对荷人卵巢癌裸鼠移植瘤的靶向显像及治疗作用
研究方法:
1.免疫靶向复合物的制备及MTT比色法检测131I-多肽及131I-单抗对淋巴管内皮细胞(LECs)的抑制作用。用Iodogen法合成131I-多肽及131I-单抗,SephadexG50柱纯化,利用纸层析法测定其标记率及放化纯。体外分别与LECs共培养,MTT法检测其对LECs生长的抑制作用。
2.131I标记VEGFR-3高亲和融合多肽在荷卵巢癌裸鼠体内靶向新生淋巴管的显像及体内分布研究。肿瘤细胞SKOV3悬液经皮下注射法建立荷人卵巢癌裸鼠模型,待肿瘤长至1.0cm3时进行实验,Iodogen法合成131I-多肽及131I-单抗,纸层析法测定标记率。多肽组鼠尾静脉注射131I-多肽3.7 MBq,单抗组鼠尾静脉注射131I-单抗7.4MBq,用0.1％戊巴比妥麻醉后,在SPECT仪下观察肿瘤显像情况。将多肽组及单抗组24只荷瘤鼠随机分为4组,分别在注射131I-多肽及131I-单抗后24h,48h,96h和168h脱颈椎处死一组小鼠,并取眼球后血,心,肝,肾,肠,肌肉,后大腿骨骼,脑和肿瘤组织,称湿重,并用r放射免疫计数器测定各组织的放射性计数,计算每克组织百分剂量率(％ID/g)和T/NT比值。
3.131I标记VEGFR-3高亲和融合多肽对荷人卵巢癌小鼠移植瘤的靶向治疗作用。肿瘤细胞SKOV3悬液经皮下注射法建立荷人卵巢癌裸鼠模型,成瘤后2周,将20只荷瘤小鼠随机分成4组,每组5只。Iodogen法合成131I-多肽及131I-单抗,纸层析法测定标记率,分别经尾静脉注射,Ⅰ组:多肽4.4μg/只,Ⅱ组:131I-多肽7.4 MBq/只,Ⅲ组:131I-单抗7.4 Maq/只,Ⅳ组:生理盐水0.2 ml作为对照组。干预后每周测量1次小鼠肿瘤的长径及短径,观察4周,计算肿瘤体积及抑瘤率。
研究结果:
1.多肽标记率为82％;放化纯度为97％,放射性浓度为39.96 MBq/ml;单抗标记率为61％,放化纯度为87％,放射性浓度为22.57MBq/ml。131I-多肽组对LECs的生长抑制率在72h达到最高,131I-单抗组对LECs的生长抑制率在96h达到最高;48h,72h及96h131I-多肽组与131I-单抗组及多肽组比较抑制率均具有显著差异(P＜0.05)。
实验所构建的裸鼠移植瘤模型成瘤率为100％。多肽组裸鼠尾静脉注射131I标记多肽后24h在移植瘤部位和。肾脏,肝脏,膀胱开始出现放射性聚集。随着时间推移移植瘤聚集放射性逐渐增多,在注射后96h时与周围组织对比最为明显,至168h时依然可见移植瘤部位显著浓聚放射性。单抗组移植瘤部位也有类似显像,但放射性明显弱于多肽组;131I-多肽能选择性长时间大量聚集与移植瘤部位,24h时肾脏每克组织百分剂量率最高,脑中最低,肿瘤排在第7位;96h时移植瘤的摄取率达到最大为39.83％,升至第1位,其次为肾脏及肝脏;T/NT值随时间延长逐渐增高,96h时肿瘤/血液比值高达31.67。单抗组移植瘤摄取率在96h同样也达到最高为23.18％,明显弱于多肽组。由此提示,131I标记多肽主要分布于肿瘤,肝脏及肾脏组织,在体内通过肾脏与肝脏代谢,并从血液中快速清除。131I标记单抗于肿瘤部位呈现低放射性分布弱于131I标记多肽提示131I标记多肽在肿瘤组织部位聚集是由肿瘤组织中淋巴管内皮高表达的VEGFR-3介导的,体现了良好的亲和性。T/NT反应肿瘤与非肿瘤组织浓聚标记抗体的差异,其值的高低直接影响SPECT显像效果。肝脏,肾脏的T/NT值始终较低,同样提示这些组织内的放射性计数较高,这与多肽及单抗从肾脏及肝脏代谢有关。
2.各组小鼠在接种部位均有移植瘤形成,成瘤率为100％。各组小鼠肿瘤平均体积大小在开始治疗时差别无统计学意义(P＞0.05),在40 mm3左右。治疗开始后,各组小鼠肿瘤的平均体积都表现为随时间增长的趋势,但131I-多肽治疗组肿瘤平均体积与多肽组,131I-单抗组、对照组相比肿瘤体积的增长速度明显延缓。治疗结束时131I-多肽治疗组肿瘤的平均体积为(291±68)mm3,131I-单抗治疗组平均肿瘤体积为(457±88)mm3而对照组肿瘤平均体积为(792±112)mm3,相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。131I-多肽治疗组肿瘤体积与131I-单抗治疗组肿瘤体积相比差异也具有统计意义(P＜0.05),多肽组与对照组平均肿瘤体积相比其增长速度相似,治疗结束时多肽组和对照组平均肿瘤体积差异无统计学意义(P＞0.05)。与对照组相比,131I-多肽治疗组的抑瘤率为63％,131I-单抗治疗组的抑瘤率为44％。移植瘤组织的免疫组化结果显示移植瘤组织新生淋巴管丰富,131I-多肽对移植瘤组织中的淋巴管内皮细胞及肿瘤实质细胞均有较强的凋亡作用。
结论:
1,Iodogen法131I标记多肽及单抗简单易行,标记率及放化纯度高;131I标记多肽对LECs有明显的抑制和杀伤作用。
2,131I标记高亲和融合多肽对荷人卵巢癌移植瘤具有良好的靶向作用,能选择性长时间浓聚于移植瘤部位,T/NT值较高,显影清晰,因此有望成为靶向卵巢癌新生淋巴管的导向剂,为卵巢癌的靶向诊断或治疗提供理想的靶向载体。
3,131I标记高亲和融合多肽对荷人卵巢癌小鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用。其抑制作用强于等浓度抗VEGFR-3单克隆抗体。