论文部分内容阅读
本研究以阿维菌素抗性、敏感小菜蛾为研究对象,从生化、靶标分子和细胞膜三方面对小菜蛾对阿维菌素的抗性机理进行了研究。具体结果如下:
1.以阿维菌素对小菜蛾进行选育,获得抗性品系。生测结果表明,阿维菌素敏感品系(XH-S)对阿维菌素的敏感度是阿维菌素抗性品系(AV-R)的1078倍,而对伊维菌素和甲胺基阿维菌素的交互抗性也达1000多倍,交互抗性测定表明说明该品系确实为对阿维菌素类杀虫药剂敏感的品系。对其它药剂的生测结果表明,AV-R对菊酯类杀虫剂有一定的交互抗性,XH-S对高效氯氰菊酯、氰戊菊酯敏感度分别是抗性的12.4和12.6倍。而XH-S对氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯、醚菊酯的敏感度分别是抗性的5.2、4.1、7.9和8.9倍。对硫丹、林丹、氟虫腈、茚虫威及多杀菌素交互抗性很低。
2.对阿维菌素敏感(XH-S)与抗性小菜蛾(AV-R)体内的解毒酶(羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶)及靶标酶乙酰胆碱酯酶的测定结果表明,两品系靶标酶乙酰胆碱酯酶的比活力没有明显差异。敏感品系和抗性品系的解毒酶羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶的比活力也没有明显差异。利用酶标仪测定抗性与敏感品系单头小菜蛾羧酸酯酶的活性测,统计不同活性段内的小菜蛾个体分布频率,结果表明两品系个体羧酸酯酶活力分布频率相同。
3.通过比较已发表的5种昆虫GABA受体基因的序列,设计了两对简并引物,应用巢式RT-PCR技术克隆获得了1069bp的小菜蛾Plutella xylostella (Linnaeus) GABA受体基因的cDNA片段,编码355个氨基酸。序列分析表明,该片段包含昆虫GABA受体基因中保守的半胱氨酸桥和3个疏水跨膜区,与烟芽夜蛾GABA受体3α亚基的同源性达96.6%,与黑腹果蝇等其它6种昆虫GABA受体的氨基酸序列的同源性是80.9~86.8%。用DNAMAN软件对其核苷酸序列分析表明,该片段与已知的儿种昆虫GABA受体的碱基序列具有62%以上的同源性;同时对推导的氨基酸序列进行疏水性分析,表明此序列包含3个明显的疏水区,且编码这3个疏水区的氨基酸分别与其它昆虫中GABA受体的M<,1>、M<,2>和M<,3> 3个跨膜区的氨基酸完全相同。
4.对抗性和敏感晶系的GABA受体基因片段序列比较发现,抗性和敏感品系有98.97%的碱基相同,在六个位点的碱基存在差异,第201位敏感品系为T,而抗性品系为G;第204位敏感品系为C,而抗性品系为T;第752位敏感品系为G,抗性品系为A;第672位敏感品系为C,抗性品系为T;第1062敏感品系为C,抗性晶系为A;第1065位敏感品系为C,抗性品系为G。由核苷酸推导的氨基酸比较发现,在第752位核苷酸中,发生的由G到A的突变导致第187位氨基酸由精氨酸(A唱)变为赖氨酸(Lys),这一突变位点位丁M<,3>和M<,4>之间。根据克隆测序的阿维菌素抗性、敏感小菜蛾GABA受体序列,依据等位基因特异性扩增引物设计原则,设计一条正向引物,西条反向引物,以阿维菌素敏感、抗性晶系小菜蛾DNA作模板,分别用正常、突变引物扩增;用正常引物扩增,阿维菌素抗性、敏感品系在300bp左右位置得到扩增产物;而用突变引物为引物时,阿维菌素抗性品系在预计的位置未得到条带。说明此突变可能为测序错误,与抗性无关。
5.不同种类的杀虫剂对小菜蛾线粒体膜流动性的影响不同。在浓度1×10<-4> mol/L时,阿维菌素类杀虫剂对线粒体膜流动性的影响最大,而高效氯氰菊酯和溴氰菊酯等拟除虫菊酯仅次于阿维菌素类,这些药剂均明显降低膜的流动性。而有机氯杀虫剂硫丹则增加线粒体膜的流动性。乙酰甲胺磷、辛硫磷及氟虫腈等对线粒体膜的流动性影响很小。测定不同药剂在不同温度下对膜的流动性的影响。结果表明,随着温度的升高,偏振度变小,膜的流动性增加,甲胺磷在不同温度下对膜的流动性影响比较小。而阿维菌素、依维菌素、甲维盐及高效氯氰菊酯对膜流动性的作用受温度影响较大。硫丹和氟虫腈在不同温度下对线粒体膜的影响基本相同,不因温度的改变而有太大的变化。利用荧光偏振法分别测定了不同温度下,阿维菌素敏感与抗性小菜蛾线粒体膜的流动性。低于25℃时,敏感与抗性小菜蛾膜的流动性明显不同,敏感小菜蛾线粒体膜的荧光偏振度低于抗性品系的荧光偏振度。